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标题:【讨论帖】朊病毒

yes4[使用道具]
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有没有任何文献证实,分子量处于25KD 和37 KD 的prion 蛋白是具有感染性的蛋白质?

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谈一谈自己的看法,相关的和不相关的。prion 蛋白由254个氨基酸组成,其分子量应为26-27Kd,但由于prion的180位和196位有糖基化位点可被糖基化修饰,的实际分子量为33Kd左右,用经典的prion 蛋白抗体3F4(Sigma)进行WB可以证实。PrPc和PrPsc的大小都是33Kd,但可以通过蛋白酶K试验进行区分,PrPc进行蛋白酶解后不能被3F4抗体检测到,而PrPsc耐受蛋白酶K的作用。

prion 蛋白的结构已经研究得较清楚,列如下:
1-23aa:信号肽序列
23-90aa:脂筏靶向信号
51-90aa:8肽重复序列(与Cu离子结合部位)
180aa and 196aa:糖基化位点
112-145aa:疏水区
178aa和213aa形成二硫键
231-252aa:GPI锚定信号肽
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nut6694[使用道具]
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prion 蛋白由254个氨基酸组成,其分子量应为26-27Kd,但由于prion的180位和196位有糖基化位点可被糖基化修饰,的实际分子量为33Kd左右,用经典的prion 蛋白抗体3F4(Sigma)进行WB可以证实。PrPc和PrPsc的大小都是33Kd,但可以通过蛋白酶K试验进行区分,PrPc进行蛋白酶解后不能被3F4抗体检测到,而PrPsc耐受蛋白酶K的作用。

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相关疾病:
感染

我对单独跑胶来判断分子量大小可以,但是,如何知道:

1。它是由原蛋白复制得来的?
2。它仍然保持其模板的感染活性?(cloner 已经解决了这个问题,下面的贴子画红加黑的部分)

我们在前面的资料中可以看到,朊病毒蛋白的致病形式与非致病形式只是构象不同,是否有这种可能,复制后的蛋白就不具有感染能力了呢?

先把这个问题 hang on 在这里,哪位朋友有了想法或答案定来告知!

一定的抗体可以识别有感染性的朊病毒,而没有感染性的不可被检测,是吗?不知这种说法是否有依据。从实验步骤看来这一步是技术关键。
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nut6694[使用道具]
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我们来看一下 图1b:对朊病毒蛋白复制没有影响的一组酶

-- RNase V1:水解双链RNA
-- RNase H:水解 DNA-RNA 中的单链 RNA,对其它类型核酸没有作用
-- DNase: 没有 specify 到底是哪一种
-- EcoRI:降解 DNA 常用酶
-- Apyrase:腺酸水解酶,能将腺三磷酸(ATP)及腺双磷酸(ADP)水解成腺单磷酸(AMP)及无机磷
-- Heparinase III: 肝素酶

前四种酶的使用很好理解,排除了DNA-RNA,dsRNA, DNA 在复制系统中的作用。

用 apyrase 的目的是:排除高能量ATP, ADP 在系统中作用的可能。因为大家都知道,水解核酸时会产生这些小分子,是否这些小分子在系统中起作用,这个考虑很重要。

下面第 5 个过关问题:

使用 Heparinase III 的目的是什么?

问题提示:heparinase III 能水解什么样的蛋白,为什么要除去这种蛋白在系统中的作用?


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现已有证据认为细胞内的RNA分子可以使prpc转化为prpsc
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这里很热闹啊!我猜测一下。
Heparinase III cleaves heparan sulfate exclusively, and does not cleave unfractionated heparin or low molecular weight heparins.

一种葡萄糖醛酸酯酶,是能降解硫酸乙酰肝素的葡萄糖苷酸内切酶(endosluconidase)。肝素酶的作用底物是硫酸乙酰肝素,可降解肝素蛋白聚糖上的侧链。肝素酶的抑制剂,如硫酸海带多糖等。

prion的180位和196位有糖基化位点可被糖基化修饰,实际分子量比27Kd大。PrPc和PrPsc可以通过蛋白酶K试验进行区分,PrPc进行蛋白酶解后不能被3F4抗体检测到,而PrPsc耐受蛋白酶K的作用。Heparinase III的加入可能其上的聚糖侧链,是否为利于Rnase或Dnase或其他更好的作用肽链?(受启发的地方:apyrase 的目的是:排除高能量ATP, ADP在系统中起作用。)

不明白的地方,图1A 中显示了对朊病毒蛋白复制有影响的一组酶,在不同的梯度时与蛋白的表达量有关,前面却出现了个M(1,3泳道),这是什么?sc是否为PrPsc 蛋白的标准样品?(由于看不到全文,icesugar75可否将NATURE全文上传)[哥哥,全文就在前面的一张贴上,再看看?M 看来是阳性对照的意思-- icesugar75 注]

prion一词原来的字源是protein由和infection, 合并而来,显然突出了它的特征:在化学性质上是蛋白质;在机能活动上具有感染性。异常蛋白的N端要少出几十个AA,从而使异常蛋白抗蛋白酶,具有感染性。这点似乎可以在基因找到类似的例子,如中华医学遗传学杂志(2001,18(4).-268-271)调查中国藏族人群中CCR5△32等HIV相关的等位基因在的频率和分布情况, 发现CCR5△32小于0.15%, 提示中国藏族人群很可能在遗传上是HIV-1易感的人群。Prion 是否也有这样的性质,也许这能从另一个方面提示对于将来预防该病毒的侵袭是否有帮助?
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PRION是PRoteinaceous Infectious ONly的缩写。
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我对单独跑胶来判断分子量大小可以,但是,如何知道:
1。它是由原蛋白复制得来的?
2。它仍然保持其模板的感染活性?(cloner 继续解决一下?)
cloner 的意思是:用一定的抗体可以识别有感染性的朊病毒,而没有感染性的不可被检测,是吗?不知这种说法是否有依据。从实验步骤看来这一步是技术关键。

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1、首先明确PrPsc为致病形式,Prpc为正常形式。

2、PrPsc的蛋白酶抗性是由于其构象改变引起的,我不知道有没有单独识别PrPsc的抗体,上面所述的单抗3F4即可识别PrPsc,也可识别PrPc,但PrPc无蛋白酶抗性,经蛋白酶K处理后就无法为3F4所识别,PrPsc和PrPc由此而可被区分。 [谢谢,这是问题的关键!icesugar75 注]

3、PrPsc似乎有分子伴侣的作用,在它的作用下,原本应该正常的PrPc都折叠成了PrPsc的形式。下面是一个示意图。[这个观点还有待证实吧?-- icesugar75 注]


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使用 Heparinase III 的目的是什么?

问题提示:heparinase III 能水解什么样的蛋白,为什么要除去这种蛋白在系统中的作用?

heparinase III是一种葡萄糖醛酸酯酶,是能降解硫酸乙酰肝素的葡萄糖苷酸内切酶(endosluconidase)。 该酶 cleaves selectively, via an elimination mechanism, sulfated polysaccharide chains containing 1-4 linkages between hexosamines and glucuronic acid residues. The reaction yields oligosaccharide products (mainly disaccharides) containing unsaturated uronic acids which can be detected by UV spectroscopy at 232 nm. The enzyme is active only towards heparan sulfate and does not cleave heparin or low molecular weight heparins.
这种酶常应用于糖生物学(99年Nobel Price),寡糖文库的制备,从heparan sulfate制备二糖.
(受启发rPsc似乎有分子伴侣的作用,在它的作用下,原本应该正常的PrPc都折叠成了PrPsc的形式),糖生物学研究表明:有的分子伴侣发挥功能需要靠蛋白上的寡糖链识别(具体文献忘了,见附件文献提到的这样的意思),而heparinase III可去除糖蛋白的可寡糖链.(Prion是一分子量为33kD~ 35kD的糖蛋白,)因此,我认为,此处可能是排除PrPsc自身作为分子伴侣辅助PrP的复制或折叠.
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本文说明:
1感染细胞如果混在正常的脑组织中,PrPres可增长6倍,去除组织中的ssRNA后,无增长;
2加入来源于鼠的外源性RNA后,PrPres可增长20倍;
3这种小ssRNA的两个特点:非脊柱动物不能增长PrPres,发挥活性需要rRAN参与;

本文并没有否定PRION仅是蛋白质的假说:
1一定大小的带电的DNA可以结合PRION,并且改变其构像,但作者的结论相反,可能和他们使用的DNA大小有关
2带负电的核酸本来就可以改变PRION的构像,但是未致病细胞的PRION和RNA被细胞膜分开,因此体内可能的情形是RNA只是“代言人”,要联合其他因子才能使PRION构像改变致病;
3这种RNA在正常哺乳动物组织中也存在
4高纯度提取PrPsc分析表明,类似大小的ssRNA并非Prion感染的所必须
5体内有多种聚合离子如硫酸葡萄糖氨基聚糖可改变Prion构像,体外实验不能模拟体内环境;
6该小ssRNA在不同宿主间有序列差异
展望:
1 本文所证实的RNA与蛋白质构像改变是否具有普遍性?还有别的蛋白质异常疾病是否也和RNA参与的蛋白质构像异常有关?
2至少目前,利用这个发现,可以提高诊断检测水平,提高生物食品、饲料安全性,尽早发现和Prion有关的疾病。
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相关疾病:
感染
生物:我們都錯怪PrPSC了?!

編輯:倫子
Prion是一種會造成羊搔癢症、牛海綿狀腦病變,以及人類庫賈式症等神經系統病變的蛋白質病原。受到Prion感染的動物,神經系統內會有PrPSC(內生性PrPC的異構物) 的堆積,伴隨著神經元損失(neuron loss)、海綿狀腦組織(spongiform)等神經病變。據此,過去普遍認為PrPSC就是造成神經毒性(neurontoxicity)的元兇。然而,最近的研究顯示,我們似乎錯怪PrPSC了。

過去幾年間,科學家皆將把PrPSC視為神經病變的罪魁禍首,因此他們利用各種方法來阻止PrPSC的危害,譬如以酵素分解PrPSC,或以抗體阻斷PrPSC的活性區域,但成效皆未達預期。Mallucci, G.的研究團隊,則採取了嶄新的觀點來看Prion所造成的問題。

根據先前研究的暗示,他們不再試圖抑制PrPSC的堆積,而從生物體本身具有的PrPC 下手。他們將小鼠的PrPC基因剔除(Knock-out mice, Prnp0/0),使小鼠無法產生PrPC,如此PrPSC便無從帶壞神經細胞內的PrPC。如預期地,Prnp0/0小鼠在受到Prion感染之後,並不會產生中樞神經的病變。更美妙的是,若將基因轉殖小鼠(transgenic mice, MloxP)感染Prion,即使小鼠已經開始產生海綿狀腦組織,其海綿狀腦組織竟可以逐漸填補修復!即使短期內小鼠腦部組織仍可偵測到PrPSC的存在,卻無法對神經細胞造成危害。

這個結果顯示,PrPSC本身並不具有細胞毒性,神經系統病變的關鍵其實在於神經細胞內PrPC的轉變(conversion)。若能抑制PrPC表現,便可阻止Prion感染所造成的危害,甚至逆轉局勢,讓已經受損的神經系統逐漸恢復。這個研究雖然只進行到小鼠階段,但對於遭Prion感染而造成神經病變的患者而言,確實是一個好消息。

原始論文:
Mallucci, G. et al. Depleting neuronal PrP in prion infection prevents disease and reverses spongiosis. Science, 302, 871 - 874, (2003).

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