蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】纯化His-tag 蛋白 不同咪唑浓度梯度洗脱 蛋白电泳图

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标题:【求助】纯化His-tag 蛋白 不同咪唑浓度梯度洗脱 蛋白电泳图

bs4665[使用道具]
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发表于 2013-7-22 13:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
呵呵，刚开始做不知道怎么算正怎么算反哦？
应该是什么样的啊？

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把这图垂直翻过来才对
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bs4665[使用道具]
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发表于 2013-7-22 13:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是说进行二次纯化吗？
还是说上样前先用含10mM Binding Buffer 平衡一下柱子？做的时候上样前有用含10mM Binding Buffer 平衡过柱子

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就是刚破完菌后，往样品里添加咪唑使终浓度为10mM左右。然后上样前柱子也要用含10mM咪唑Binding Buffer平衡一下，减少一些非特异性吸附
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发表于 2013-7-22 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道你最终要求多少的纯度的？

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个人觉得只靠一个NI柱请亲和的纯化几乎是不可能做到特别高的纯度的。
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hulu呼噜[使用道具]
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发表于 2013-7-22 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

缓冲体系，pH及盐浓度
对于一些作用力弱的蛋白不能选择带氮原子的的一些缓冲体系，如Tris-HCl等，适当提高缓冲液pH可以增加吸附效果，同样原理可以降低pH洗脱一些咪唑洗不去的杂带。为避免由于电荷作用的干扰，平衡缓冲液中需要加0.1-1M氯化钠，而在平衡缓冲液添加0.1-0.5%吐温或者triton可以降低由于疏水相互作用导致的非特异吸附。
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standbyme[使用道具]
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发表于 2013-7-22 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我刚开始做，也不是很懂，我是想200mM下还是有杂蛋白，这样纯化出来的蛋白不纯啊
而且目标蛋白在60mM时就开始被洗下来了，这样正常吗？

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你在洗脱前，先用20mM咪唑的洗涤液洗2~3遍再用200mM的咪唑洗脱
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shanzhapia696[使用道具]
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发表于 2013-7-22 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道你最终要求多少的纯度的？

个人觉得只靠一个NI柱请亲和的纯化几乎是不可能做到特别高的纯度的。

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想在纯化之后做一下蛋白的Km值，最适pH，还有最适温度之类的表征
做这些是不是需要很纯的蛋白呢？
Ni柱纯化后的蛋白可以做这些表征吗？
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shanzhapia696[使用道具]
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发表于 2013-7-22 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
缓冲体系，pH及盐浓度
对于一些作用力弱的蛋白不能选择带氮原子的的一些缓冲体系，如Tris-HCl等，适当提高缓冲液pH可以增加吸附效果，同样原理可以降低pH洗脱一些咪唑洗不去的杂带。为避免由于电荷作用的干扰，平衡缓冲液中需要加0.1-1M氯化钠，而在平衡缓冲液添加0.1-0.5%吐温或者triton可以降低由于疏水相互作用导致的非特异吸附。

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谢谢，我再调pH试试~
感觉很难得到很纯的蛋白啊
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shanzhapia696[使用道具]
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发表于 2013-7-22 13:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你在洗脱前，先用20mM咪唑的洗涤液洗2~3遍再用200mM的咪唑洗脱

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嗯，好
以前用的10mM，现在改成20mM的试试
谢谢啦
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2013-7-22 13:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我感觉你蛋白挂柱有问题。挂的不多。
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