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标题:[未解决]各位做蛋白相关的都来看看

  [未解决]本主题悬赏 可用分 10  
兜兜[使用道具]
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发表于 2013-7-23 13:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各位做蛋白相关的都来看看

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求助求助，各位做蛋白相关的都来看看
我做了一个α-乳白蛋白的酶解，在加入DTT和IAA之后，有部分蛋白沉淀出现了，然后我又做了一个不加DTT和IAA直接酶解的样本，这两种样本我都进了质谱，可是信号不是很理想。
我想问下专业的同志们，这两种的酶解理论上是不会有太大区别的吧？
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mr.henry[使用道具]
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发表于 2013-7-23 13:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
两种区别还是有的，这要具体情况具体分析。DTT用于打断二硫键，IAM用于烷基化，防止打断的二硫键重连。
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发表于 2013-7-23 13:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
类似实验我没有做过。以前有接触过。lz你这蛋白多大？疏水性会不会很强？
越大的蛋白，或者疏水性越强的蛋白，越难切。
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发表于 2013-7-23 13:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在酶切前，要经过变性，如果蛋白很难搞，变性剂要加比较强的比如说Guanidine HCl，然后再分别加DTT和IAM，但是，变性剂其实也会影响酶活。。。你后面的酶切也有可能受影响。
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发表于 2013-7-23 13:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有许多需要考虑的东西，最好先找你这个蛋白别人的文献条件，按别人的条件先做做。
另外，要进质谱，信号不太好？ESI源还是MALDI源？你流动相用的FA还是TFA？
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冰@舟[使用道具]
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发表于 2013-7-23 13:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你蛋白都不变性，空间结构不展开，后面的DTT、IAA、Trypsin怎么可能会有效果，一般用6M的盐酸胍或者8M的尿素在56度DTT存在下变性。酶切效果不好就用顺序酶切，不过这不光是酶的问题，你的质谱型号、上样量溶剂体系什么不说我们也不知道啊
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