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标题:【求助】蛋白定量方法的哪个好？

vera+[使用道具]
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发表于 2013-7-26 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

也许每个人的试验体会不一样吧。G250法测微量蛋白是不可靠的。但在蛋白含量较高时还可以，我做出来的曲线重复性还是很好的。BCA很贵，操作时也要很小心，因为是微量测定，很小计量的污染都会大大影响测量的结果。
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发表于 2013-7-26 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

BCA法测蛋白含量能很好的去除如去污剂的影响，灵敏度高，同时它又是lorry的改进方法，是一个很好的测蛋白含量的方法，不过确实贵了点
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9900[使用道具]
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发表于 2013-7-26 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我需要做大鼠尿蛋白定量，许多人推荐我用考马斯亮蓝方法，我以前没用过这种方法，请教都需要准备哪些东西，在哪里可以下载这个方法的具体步骤以及注意事项？先谢过了！
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9900[使用道具]
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发表于 2013-7-26 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是用Lowry法测蛋白浓度。
哪种方法准，要根据你的蛋白具体来确定，因为Lowry法的原理是酪氨酸在起作用，用的蛋白质标准是BSA，所以它要求你的待测蛋白的酪氨酸与BSA中的酪氨酸残基数差不多的情况下就比较准，所以说哪种方法准要视具体情况而定。
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damingxia0904[使用道具]
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发表于 2013-7-26 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
方法   原理   灵敏度(mg/ml)   备注
Lowry法  碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质铜复合物该复合物随之将磷钼酸磷钨酸还原成蓝色复合物  0.025-0.25  650nm
G-250染色法  蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化从而改变这些染料的光吸收.考马斯亮蓝G-250 在酸性溶液中为棕红色当它与蛋白质通过范德华键结合后变为蓝色  0.01-1  595nm
凯氏定氮法  有机物与浓硫酸共热,有机氮转变为无机氮氨,氨与硫酸作用成硫酸铵,后者与强碱作用释放出氨.借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此过量酸液被中和的程度即可计算出样品的含氮量,再推知蛋白含量  0.2-2  
双缩脲法在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫红色复合物。蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与铜离子在碱性环境中形成紫红色复合物。  1-10  54Onm
215&225吸收差法  蛋白质的肽键在200-250nm有强的紫外吸收，且波长越短光吸收越强。若选用215nm可减少干扰及光散射。用215nm 和225nm 光吸收差值可减少非蛋白质成分引起的误差。  0.02-0.1  mg/ml=0.144(A215-A225)
280吸收法  蛋白质中的W和Y残基的苯环中含共轭双键，在280nm有最大吸收  0.1-1  280nm
280&260吸收差法  核酸260nm的吸收比280nm强，而蛋白质正相反，  0.1-1
  mg/ml=1.45A280-0.74A260
可以根据你要求的精度，可信度，结合试剂的价格和操作的难易选择一种就可以了。
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wsll[使用道具]
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发表于 2013-7-26 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

诸位, Bradford 法和 (Coomassie Blue) 考马斯亮蓝G-250 法是一回事么? 我用前者, 简单,快速,灵敏而且不易受其他干扰物质的影响, 用于估计蛋白含量相当不错.
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发表于 2013-7-26 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 wsll 于 2013-7-26 17:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

诸位, Bradford 法和 (Coomassie Blue) 考马斯亮蓝G-250 法是一回事么? 我用前者, 简单,快速,灵敏而且不易受其他干扰物质的影响, 用于估计蛋白含量相当不错.

考马斯亮蓝G—250法于1976年由Bradford建立。所以考马斯亮蓝G—250法又叫 Bradford法。
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发表于 2013-7-26 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们这用G250法感觉好像也不准，提的蛋白用标准曲线算不出，为负值，难道蛋白都跑没了? 不知各位战友用G250法做的结果如何？
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2013-7-26 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 qhyu 于 2013-7-26 17:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我们这用G250法感觉好像也不准，提的蛋白用标准曲线算不出，为负值，难道蛋白都跑没了? 不知各位战友用G250法做的结果如何？

目前世界上最常用的两种蛋白浓度检测方法：Bradford法和BCA法
Bradford法（也叫考马斯亮蓝G—250法）测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。样品中atteb-巯基乙醇的浓度可高达1M，二硫苏糖醇的浓度可高达5mM。但受略高浓度的去垢剂影响。需确保SDS低于0.01%，Triton X-100低于0.05%，Tween 20, 60, 80低于0.015%。另外Bradford法是基于酸性溶液的反应。
BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20, 60, 80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA低于10mM，无EGTA，二硫苏糖醇低于1mM，β-巯基乙醇低于0.01%。不适用BCA法时建议使用Bradford法。
美国FDA批准用BCA法蛋白定量。
你在实验中要注意比色皿一定要在每次测量后立即用95%乙醇浸泡，然后洗净，再用蒸馏水洗净，不然会影响结果。另外要先测低浓度的样品，后测高低浓度的样品。如果自己测量有问题，那就买试剂盒吧，Bradford蛋白浓度测定试剂盒和BCA法测定试剂盒都有。Bradford法的便宜一点。
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8princess8[使用道具]
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 小中大

我们是做药品生产检测的,在测定蛋白含量是还是用LOWRRY法的,因为<生物制品规程>就是这样规定的
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