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标题:【求助】蛋白定量方法的哪个好？

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发表于 2013-7-26 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我需要做大鼠尿蛋白定量，许多人推荐我用考马斯亮蓝方法，我以前没用过这种方法，请教都需要准备哪些东西，在哪里可以下载这个方法的具体步骤以及注意事项？先谢过了！

参见汪家政《蛋白质技术手册》上面说的很详细。其实很多有关生化实验技术的书都有介绍的。
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发表于 2013-7-26 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做过考马斯G250法，发现不同时间有影响，而且显色液每次用前要过滤，否则有絮状物，结果稳定性不好。文献上把它吹得多好多好，有点骗人。
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发表于 2013-7-26 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

其实可以自己摸索一下了，考法确实挺麻烦，显色液每次都要过滤，但是用熟了，也就不会觉得麻烦了，每一种方法都有它一定的局限性，多数战友推荐的都是自己用的比较好的方法，你也可以摸索出一种适合自己实验的合适的方法出来压
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04906[使用道具]
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发表于 2013-7-26 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们实验室（基因工程）一直用BCA法，是师姐以往老看国外论文上用此法而购买的。觉得比较简便，标准曲线重复性很好。其实不应该算贵吧。我们买了一大瓶，全实验室人用，五年多了，才用一半不到。所以觉得不应该算贵。
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发表于 2013-7-26 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是G250，还可以，标准曲线很好。
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发表于 2013-7-26 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

G250的配制时需注意考马斯亮蓝必须在乙醇完全溶解后再加磷酸，溶液难，可用37度 5‘ 100W超声溶解，这样做出的两个曲线都很稳定，另外，可用G250粗测，再用lowry，推荐使用新法lowry测蛋白。而生物制品规程版本的不准确。
即BSA先稀释成1mg/ml母液（-20度保存）用时稀释为0.5mg/ml，各管分别取0，0.1,0.2,0.3,0.4,0.5ml,补足水到总体积0.5ml。而待测样品稀释为0.25mg/ml左右也取0.5ml.每管加入（25ml无水碳酸钠+0.25ml 0.5%五水硫酸钙+0.25ml 1%酒石酸钠）上述混合液0.25ml/管。10’后加入1N FOLIN酚试剂 0.25ml/管，注意混匀。30‘后500nm测OD。
此法很准确。
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2013-7-26 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们用Bradford法，这个方法很好。但关键是要掌握好蛋白与solution反应的时间，这非常重要！
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发表于 2013-7-26 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们实验室（基因工程）一直用BCA法，是师姐以往老看国外论文上用此法而购买的。觉得比较简便，标准曲线重复性很好。其实不应该算贵吧。我们买了一大瓶，全实验室人用，五年多了，才用一半不到。所以觉得不应该算贵。

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能不能详细说说protocol，对你的方法有兴趣，又懒得查书，^_^，
BTW：是不是每次测的时候都要测标准曲线？还是只要刚买回来的时候测一次就行了？
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c86v[使用道具]
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发表于 2013-7-26 17:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们实验室主要也是用BCA法，用的是碧云天的试剂盒，两三百元一个吧，能测500个样。我们实验室不少人觉得BCA的标曲不好做，我的经验是把标曲留在最后做，并且使用梯度稀释的方法来加蛋白标准品，这样每次的加样体积都固定，而不是按照说明书的固定浓度而体积梯度变化，感觉那样的话在加样体积小的时候误差比较大。感觉用这种方法做标曲基本都能一次成功。
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