蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】能否在一个表达载体里插入两个蛋白实现同时表达

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标题:【求助】能否在一个表达载体里插入两个蛋白实现同时表达

caihong[使用道具]
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发表于 2013-7-27 09:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
原核一般多个RBS就可以了 真核也很方便，至少三到四种策略
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2013-7-27 09:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
原核的共表达Novagen　有专门的pET共表达载体
楼上兄弟的文章也有涉及到
Merk的技术资料中，最多可在一个菌中用4个复制原点互不相同的质粒载体表达８个不同的蛋白
每个质粒复制原点不同，因而可以在一个菌种共同复制
每个质粒上都有两个独立的表达盒，用于表达两个外源基因
真核细胞内的共表达与此类似

有图为证

===========================================================

这个问题其实有点类似于多个抗原混合免疫了，一举多得

请教一下，举个例子像pGEX PET42这两种不同的质粒能共转一个BL21菌株么？

一个是T7一个是tac启动子
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发表于 2013-7-27 09:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在实际生产和科研中，这样共表达的实用性和成功率如何？

也没有做过的战友，介绍介绍经验
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qumm1985[使用道具]
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发表于 2013-7-27 09:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

两个蛋白的生产中很普遍了 最常见就是表达抗体 ，重链轻链要一起表达 ，我这三个蛋白共表达原核，真核都有表达成功的例子
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2013-7-27 09:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 qumm1985 于 2013-7-27 09:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

两个蛋白的生产中很普遍了 最常见就是表达抗体 ，重链轻链要一起表达 ，我这三个蛋白共表达原核，真核都有表达成功的例子

真核共表达比较常见，对原核的共表达有点兴趣，像您所说的3个蛋白共表达，3个都是包涵体还是可溶？分别用的什么载体？3个蛋白共表达时和单独表达时，表达量有明显变化吗？
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qumm1985[使用道具]
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发表于 2013-7-27 09:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
就用一个载体将三个基因用RBS连接后克隆到载体的一个表达盒里 转录出一条mRNA链条 再依靠RBS分别翻译出三个蛋白。
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2013-7-27 09:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个问题其实有点类似于多个抗原混合免疫了，一举多得

请教一下，举个例子像pGEX PET42这两种不同的质粒能共转一个BL21菌株么？

一个是T7一个是tac启动子

===========================================================================================================

我想你有点混淆了
我上面打的也不是太清楚
准确的说应该是复制子，而不是复制原点（ori)
简单的说，质粒复制子是质粒DNA复制的最小元件，复制子决定了质粒的复制方法
和基因表达元件的启动子不是一回事
启动子决定了基因被什么样RNA聚合酶所识别，是转录起始信号

通常情况下，两种（或两种以上）质粒在同一菌株中能够相容的先决条件是复制子不能相同
如果复制方式相同或相似，利用同一复制系统的两个质粒会在复制和随后向子细胞的分配过程中彼此竟争，这样的质粒在细菌培养物中不能和平共处。这种现象称之为不相容性。（忽然想起泡利不相容原理和洪特规则来了，下面就会说到特例）

然而此种因素没有将选择压力考虑在内，pGEX6p1和pET42都是pBR322 origin，理论上不可以在一个细菌内相容的，但二者抗性不同，在　Amp 和Kan　共同维持下，也会稳定存在于一个细菌内的。
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2013-7-27 09:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
就用一个载体将三个基因用RBS连接后克隆到载体的一个表达盒里 转录出一条mRNA链条 再依靠RBS分别翻译出三个蛋白。

=================================================

构造多顺反子也是可行方案，最常见的例子就是乳糖操纵子了。
但要考虑启动子启动能力强弱与作用距离以及基因大小等问题。
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qqq111[使用道具]
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发表于 2013-7-27 09:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个帖子真好，核酸版也曾经有战友问过类似的问题（cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/6438665_1.html')），只是当时没有引起关注。关注共表达很久了，一直没有着手～～～～在这里学了很多！
谢谢！
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2013-7-27 09:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想你有点混淆了
我上面打的也不是太清楚
准确的说应该是复制子，而不是复制原点（ori)
简单的说，质粒复制子是质粒DNA复制的最小元件，复制子决定了质粒的复制方法
和基因表达元件的启动子不是一回事
启动子决定了基因被什么样RNA聚合酶所识别，是转录起始信号

通常情况下，两种（或两种以上）质粒在同一菌株中能够相容的先决条件是复制子不能相同
如果复制方式相同或相似，利用同一复制系统的两个质粒会在复制和随后向子细胞的分配过程中彼此竟争，这样的质粒在细菌培养物中不能和平共处。这种现象称之为不相容性。（忽然想起泡利不相容原理和洪特规则来了，下面就会说到特例）

然而此种因素没有将选择压力考虑在内，pGEX6p1和pET42都是pBR322 origin，理论上不可以在一个细菌内相容的，但二者抗性不同，在　Amp 和Kan共同维持下，也会稳定存在于一个细菌内的。

================================

那按您的意思是可以共存，那能都表达么？
有这方面经验的朋友么
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