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标题:【讨论帖】就跑胶时的细节,如电压,PH,离子浓度等讨论

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-7-27 10:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 mamamiya 于 2013-7-27 10:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

胶浓度大压的也会紧一些的

另外PH不对会影响压的效果，比如加完loading buffer后溶液都是黄的时候，如果跑胶就会很弥散，甚至把别的泳道都给挤掉了 ...

溶液发黄，说明是buffer过酸，过酸会有什么不良后果？
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=pkchen=[使用道具]
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发表于 2013-7-27 10:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 ukonptp 于 2013-7-27 10:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


溶液发黄，说明是buffer过酸，过酸会有什么不良后果？

溴芬兰带拖得很长,甚至会拱形峰形,碰到过两次这种情况了.

cake说得电压,是这样子得,
我跑SDS-PAGE的时候,用80V 100V最多,

如我前面所说,我的胶里加了甘油,电阻很大,而我的电泳仪最大只能达到300V,所以如果两块胶都加甘油,电流相当小了,打到300V,电流只有2-3mA,电泳仪不WORK,又不可能去买个高压电泳仪,
所以就想了这么一个法子,另一块就做normal gel,这样电压到300V时电流就上来了,能达到六十几mA,怕散热不好,所以我都放冰里电泳的,否则胶到后面加样孔都变形了,

做SDS-PAGE的时候,溴芬兰普遍压的没有这三个图好看,不是电压的原因,因为甘油胶电流还是小的,而且我个人认为SDS-PAGE时电压的问题是不大的,如100V和60V压的差不多,电压再高我就没有试过了.
大家可以来些图片
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2013-7-27 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人认为电压有一定影响，我有时候是60V开始跑上层胶，然后去吃饭，回来一般已经开始跑到下层胶了，这时溴芬兰弥散，但是我将电压升上去到140V跑下层胶以后，也就10min左右就又压成一条线了，不知道是什么原因
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2013-7-27 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

参加讨论，看了iris的图片，300v,我也觉得有点大，而且一直恒压， 其实我自己也是一直用恒压来跑浓缩胶和分离胶，主要是嫌麻烦，而且也没有觉得有什么太大影响，不过仔细想想，为了跑出漂亮的结果，还是应该用不同电压。

一般的protocol都指出浓缩胶和分离胶 用不同的电压跑，
浓缩部分用低电压或低电流（50至70v,20至40mA），待样品在浓缩胶底部浓缩成一条直线后，再加大电压或电流（150至200v，40至60mA），待溴芬兰指示剂到达底部边缘时即可停止电泳

浓缩胶 (stacking gel), 名字也可以看出来，目的是使loading 的样品能够在同一条水平线上进入分离胶 ，如果电压太大前端的蛋白在后面的蛋白之前进入分离胶。其实分离理想效果是应该在小电压长时间分离的效果会更好，但是在操作过程中没有必要等那么长的时间，所以就用大电压快点跑。
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2013-7-27 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另外，电压大小对跑胶的质量是有影响的，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好
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duoduo[使用道具]
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发表于 2013-7-27 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那就是说电压小点是没关系的了，我跑胶时电流非常小，跑得很慢，所以经常加大电压跑，可能这样也有影响吧，有时跑得跟大雁样。
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2013-7-27 10:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看了一些资料，补了一下基础知识，终于找到答案了。

配胶缓冲液系统 pH对电泳的影响很大。

制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
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发表于 2013-7-27 10:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

说实话，我一般很少遇到过sds问题呵呵，可能人品比较好。
一般来说出原因，我遇到的
1，内槽液在跑的过程中外漏，这样会跑出拱形
2，如果内槽液PH出现问题那么胶下半部分会很弥散。
我们都是上层胶一块胶跑20mA，下层胶跑40mA恒流，感觉效果不错，而且速度快，所有的配方都是从分子克隆上的。
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applebook=213[使用道具]
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发表于 2013-7-27 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我遇到的问题是我的电泳液最近在70V电压下电流显示50mA左右。当分离胶时我把电压调到120V,此时的电流高到100mA。所以我的条带跑的很不好看，弥散很大。以前可没出现过这种情况。另外我的电泳液是新配5X的。用时直接稀释1X的用。大家看看问题出在哪里啊？
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