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标题:【求助】肠激酶酶切后出现规律的非特异条带

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发表于 2013-7-27 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我遇到了相同的问题，用EK酶切有严重的非特异性条带出现。融合蛋白20K，标签17K，目的肽段3K，EK过夜切后有17K和14K两条带出现，20K处的条带完全消失。不明白这是怎么回事。

蛋白之安基兄提到EK可以错误切割thrombin位点，可有相关的文献依据？怎样避免类似的错误切割呢？
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发表于 2013-7-27 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家好，我以前也用过EK,
切的是Trx,摸索了很多条件，但总不成功，切出来的图跟楼主的一模一样！！！
想在这里统计一下，请问以上用过EK的战友们，你们是不是也是切的Trx呢？
如果有问题的都是Trx,而切别的标签就没问题，就说明Trx确实有EK识别位点。以后可以注意一下，以防以后的战友再出现这样的麻烦。
谢谢！
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发表于 2013-7-27 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我遇到了相同的问题，用EK酶切有严重的非特异性条带出现。融合蛋白20K，标签17K，目的肽段3K，EK过夜切后有17K和14K两条带出现，20K处的条带完全消失。不明白这是怎么回事。

蛋白之安基兄提到EK可以错误切割thrombin位点，可有相关的文献依据？怎样避免类似的错误切割呢？

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您好!
20K的条带没了,说明切的还可以啊,3K的条带您应该能看到啊,您跑tricine胶可以看到3K的条带,但您的上样量要大.
我没有搜索这类文献,做的多了,个人的经验啊,仅供参考,呵呵
不可以避免啊,惟有多加EK的量.
我最近也做了个4K的目的蛋白,呵呵
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发表于 2013-7-27 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很遗憾，这次在柱上酶切，酶的用量也足够大，仍然没有切出来。
打算再尝试最后一次，还不行就放弃。
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如影随形[使用道具]
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发表于 2013-7-27 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很奇怪，我的实验证明，我的目的片段上的终止子没有起到作用，终止发生在载体的终止子上！
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发表于 2013-7-27 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大哥们:
我遇到和大家相似的情况，我的融合蛋白21kd左右，酶切前目的条带很纯
酶切6-20小时后，产生了两天新的条带，分别为17kd和15kd位子，而且除了21kd原条带没有其他的新条带。
我用酶切后的样品再上ni柱，在线280nm检查没看到吸收峰，流穿、洗脱液分别跑电泳
结果流穿中没有，0.1M咪唑洗脱液中有17kd和15kd的条带。
郁闷！！！
酶切后两条带怎么都带了his呢？
目的蛋白也不见！！！
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发表于 2013-7-27 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

硫氧蛋白大小到底是多少啊？我用空的PET32载体与克隆了目的基因的载体加IPTG诱导后跑电泳，发现空的PET32载体在20多kd的位置多一条带啊。
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发表于 2013-7-27 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

trx标签可以被EK酶降解,随着反应时间的延长和温度的升高，降解程度越严重，且温度影响更甚。
建议低温，长时间酶切，我的蛋白就是酶解16度 20个小时。
然后可以有适量咪唑，降低EK酶活性，防止或减少非特异酶切，前提是你的融合蛋白够好切，我的蛋白可以1u：30mg，然后在100mM咪唑的情况下，还是能完全切开，这时的trx基本上不会被降解，如果不够好切，建议在DDDDK 后添加几个柔性氨基酸（A，I等），充分暴露位点。可以考虑10或者20mM的咪唑，这也可以省去了提纯融合蛋白后透析的那一步，减少蛋白损失。祝实验成功
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DONT[使用道具]
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发表于 2013-7-27 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还建议一下，电泳胶集层胶染色前可以去掉，减少染色脱色时间以及减少染液的浪费
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luoliqiong[使用道具]
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发表于 2013-7-27 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大家好，看到上面的讨论结果才晓得原来大家都遇到了跟我类似的问题
我用的也是PET32载体，融合表达后分子量是29KD，我用EK酶酶切之后发现我的蛋白被切的很乱，其中出现17KD（应该这个才是正常的标签带），15KD,14KD，12KD（这个是我的目标带）四条带。而且我需要的12KD的目标带很弱，最浓的带在15KD，I4KD位置。我做了WESTERN之后发现17KD,15KD,14KD那些带都带有组氨酸标签，我很是郁闷，因为我要的目标带收率极低，但我也是搞不明白为什么会出现15KD,14KD这些带。如果是切的是凝血酶位点，14KD又是怎么出现的呢？搞不懂，搞不懂。
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