细胞生物学

第  一  部  分 流式细胞术的一般介绍

概念
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。

流式细胞仪（Flow Cytometer)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。

流式细胞仪特点



FACSCalibur

临床型（台式机）



特点：
光路调节系统固定
自动化程度高
操作简便
使用寿命长
配备1-2根激光
细胞分选速度慢，
主要用于细胞分析


科研型（大型机）

特点：
多数字化
适用用各类细胞分选
4路分选

科研型
特点：
分辨率高
选配多种波长和类型激光器
可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板）
适用于高速分选和多色分析

流式细胞仪检测范围



临床研究
  淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度

基础研究
  淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究

流式细胞仪的工作原理

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-光学系统
   激光光源
  光收集系统
-液流系统
  流动室
   液流驱动系统
-电子系统
  光电转换
  数据处理系统
-细胞分选系统
激光光源
单波长、高强度、高稳定性
多采用氩离子激光器或氦氖激光器
一般选配2-4根激光，488nm 、633nm和355nm、407nmUV激光
最多检测13个荧光参数



光收集系统：滤光片

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光收集系统：光电倍增管（PMT）



FACSCalibur 光路图

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液流系统：流动室、液流驱动系统

[ 本帖最后由 aa1380 于 2010-2-4 00:29 编辑 ]

液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱



细胞分选系统



Fluorescence Activated Cell Sorting

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信号检测--散色光



它反应细胞FSC（小角散射)光它反应细胞的相对大小和截面积的大小
SSC (90度角散射光)代表细胞的颗粒度和精细结构的变化
的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同类型的细胞群加以区分

信号检测--荧光信号

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单参数直方图（Histogram）



X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系
Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率








便于数据统计
不同的细胞群可以用不同的颜色标记
主要表达方式

光谱交叉



两色以上荧光分析存在 光谱交叉

荧光补偿方法



所有补偿调为“0”
调节电压，用同型对照或阴性对照，使阴性群位于“左下角”
依单阳群体调节荧光补偿

抗体使用原则
根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体
低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素，如PE、APC
使用双标以上抗体必做荧光补偿



[ 本帖最后由 aa1380 于 2010-2-4 00:35 编辑 ]

第二部分 流式细胞术在不同领域的应用
细胞周期分析
样品制备

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建立获取模式，获取数据（PI单染分析细胞周期，同时看凋亡）



去甲斑蟊素对肝癌细胞周期的作用

数据分析



细胞凋亡分析
Annexin V-PE/7-AAD双染色法



双阴：活细胞           Annexin V-PE单阳：早期凋亡细胞
双阳：晚期凋亡细胞    7-AADd单阳：坏死细胞



人外周血淋巴细胞亚群检测





CD8+Ts淋巴细胞检测




B淋巴细胞检测



NK细胞检测



结束语
     流式细胞术是一种应用范围极广、灵活性很强、技术含量较高、具有众多开发潜能、富有挑战性的技术，需要掌握很多交叉学科知识，我们的宗旨是将这项高新技术灵活运用于临床、科研等领域，报告最科学、最真实的客观数据，以服务于全社会。

[ 本帖最后由 aa1380 于 2010-2-4 00:49 编辑 ]

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流式细胞技术好像很有用呢，我做过检测细胞损伤的