样品前处理

DNA是生物遗传信息的载体，快速提取高分子量、纯净的DNA是进行核营酸序列测定、基因文库构建和遗传转化等研究的重要步骤。研究以水稻、小麦、大麦、大豆、豌豆和紫云英等为材料，比较了三种改良法提取植物DNA的效果。结果表明，三种改良后的方法不仅保留了原法的许多优点，而且方法简单，不经 cscl：密度梯度离心能较干净地去除蛋白质及RNA，获得较纯净的、大分子的双链DNA,在不同程度上满足了各种植物提取DNA的需要。 关键词：植物，脱氧核糖核酸，提取，方法 与动物细胞相比，植物细胞除了有细咆壁外，还含有大量的多糖、脂质、色素和酚类物质，为DNA的提取与纯化带来了很大困难。目前常用的提取方法是在应用多种有机溶剂振荡提取的基础上，加之以CSC12密度梯度超速离心[8,19,11]，这种方法虽然效果较好，但难以为一般实验室所采用。 在前人研究的基础上，我们对常用的DNA 提取法加以改进，并进行比较研究。改进后的提取法能在不同程度上满足各种植物提取 DNA的需要，获得较纯净的、大分子的双链 DNA. 材料与方法 （一）材料将水稻（中花9号、金梗1号和紫色稻）、小麦（苏麦3号、60015)、大麦（早熟3号、 508018)、大豆（古田豆）、豌豆和紫云英等植物的种子，用0.1务HgC12消毒后，在适宜条件下浸种、催芽、暗培养，待黄化苗长到一定高度时，置一18℃冰室冷冻1-3天，备用。 （二）试剂 RNase (Merck Co.，West Germany）和胰蛋白酶(S咭ma Co., USA)，其余均为国产分析纯试剂。 （三）方法与分析 1．提取方法改良饱和酚法根据傅焕延等〔73的方法修改。提取液加裂解缓冲液水浴保温悬浮处理1 小时后，分别以饱和酚、饱和酚和氯仿异戊醇、氯仿异戊醇重复抽提2次，加人RNase，于370C 水浴中保温30分钟。提取过程离心均为4- 10℃ 下10000转／分、1，分钟。 改良氯仿异戊醇法参照陈永强〔们和米景九等127方法改进。以95多冷乙醇沉淀，低温下高速离心获得粗DNA溶液后，经5mo1 NaCIO4, 22% SDS和24:1 (V/V)氯仿异戍醇混合溶剂高速离心重复抽提2次，再加人RNase去除 RNA，即可获得纯化的DNA溶液。 改良胰蛋白酶法据白永延C1]介绍的方法改进。在“多冷乙醇沉淀离心后获得的粗 DNA溶液，加人2mo1 NaC121 95外冷乙醇、 RNase低温高速离心与水浴保温相结合，以获得纯化的DNA溶液。 提取前，试验材料均需置一18℃下冷处理不少于2天。研磨时，应加人少量石英砂，以达到快速破壁的目的。 2．光密度值与光谱扫描光密度值与光谱扫描均在Shimadzu uv-120紫外分光光度计上进行。 3．纯度测定DNA回收率（浓度）、RNA含量和蛋白质含量分别采用二苯胺法【31 苔黑法’，，和双缩豚法1510另外，测定了各种方法获得的DNA的热变性值，以初步了解双链DNA的大小。