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标题:【求助】原核表达做了两个月，没结果

yychen[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

pET-a-c(+)、pET-41Ek/LIC、pET-42a-c(+)都带GST啊，可以试一试。既然是融合表达，那么目的基因中的稀有密码子应该不会有太大影响。alishang说在起始的前25或40个密码子内的稀有密码子情况，这段肯定在GST基因内（当然如果是N端融合的话）。
另外可以做western-blot(用抗GST的抗体即可）看看是否有表达。
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am10[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yychen 于 2013-7-30 17:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

pET-a-c(+)、pET-41Ek/LIC、pET-42a-c(+)都带GST啊，可以试一试。既然是融合表达，那么目的基因中的稀有密码子应该不会有太大影响。alishang说在起始的前25或40个密码子内的稀有密码子情况，这段肯定在GST基因内（当然如果 ...

融合表达稀有密码子无影响？不知有无文献证明？本实验室表达一个11kDa的蛋白，在多个载体不能表达（包括pGEX,GST融合, 碳端），经改造后在同一pGEX载体里表达。
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我认为稀有密码子是大肠杆菌不能提供这样的密码子，融合表达应该也会受稀有密码子的影响．
另外，我想问一下你的１１kD的蛋白经过怎样的改造可以在ＰＧＥＸ载体表达？
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教：
　　用ＧＳＴ融合蛋白表达，是不是不管目的蛋白有没有表达，GST都应该有比较强的带出来？
我现在的问题是，检测PGEX空载GST有表达，但重组质粒诱导没有表达，连GST也没有。我的目的蛋白8KD大小，不是膜蛋白，没有信号肽，没有稀有密码子。

谢谢！
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koook5695[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
小生作一新分子的原核表达，预测分子量9.0 KDa左右，载体是pGEX-2T,GST融合载体，测序也正确，试过37度，30度，28度，IPTG 0.4－1.0mM，都不表达，连包涵体都没有。真急人啊。各位提提建议，不甚感激！

=======================================================================

我说一句很faint的话，不要打我啊，我只是一直小菜鸟啊。

你的IPTG有没有失效？

我曾经这样啊，换新配的就没事了，印象中温度和光会让它失效，是不是这样啊，请教各位高手。
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢，我的IPTG没有失效。还有哪位不吝指点？多谢！！
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嗅嗅[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

人多力量大啊，集思广益！谢谢各位的宝贵提议。我的这个分子中，稀有密码子没有连续的，分布于第2个（T），第五个（s），8，15，19，24，25，31，32，35，47，48，50，53，62，65，66，总共81个氨基酸。要改造还不知道怎么作？请alishang 教教，融合PCR怎样作的？至于IPTG应该没有失效，实验室其他人都是用的这。不过我的GST是表达有的。而且我还发现一个现象，未诱导的细菌量比诱导的要少多了，培养和诱导时间都是一样的啊？但有人说IPTG对细菌生长有毒性，诱导的细菌长的慢，真搞不懂咋回事？
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我知道像BL21菌株不能识别AGG和AGA两种精氨酸密码子，如果序列中这两个密码子较多的话就会影响表达，不知道会不会是这方面的原因？
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢！还要请教:
1 我没有看到目的条带会不会是蛋白表达量仍然很少? 是不是只要有,就可以用western 检测?
2 我的目的蛋白只有8KD,如过我用his tag做融合表达,这样融合蛋白分子
量 14 KD,可以做吗? 因为我这有PET28,是his tag 的.
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yueban-1147 于 2013-7-30 17:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢！还要请教:
1 我没有看到目的条带会不会是蛋白表达量仍然很少? 是不是只要有,就可以用western 检测?
2 我的目的蛋白只有8KD,如过我用his tag做融合表达,这样融合蛋白分子
量 14 KD,可以做吗? 因为我这有PET28,是h ...

1，在你的对照样品设置完全的情况下，仍然没有看到特异的条带或粗细有差别的条带，则可能是你的蛋白没表达。大多数情况下，只要表达，都可看出来。western 检测是灵敏的，不管有没有，作western 检测验证是很必要的（前提是操作和试剂都没问题）。
2，我以前一直受目的蛋白小不易与His等融合的影响（在普通胶上不易分辨），但用HIS融合，纯化有优势。你的蛋白融合后有14KD，还是可以做的，15％SDS胶应是可以分辨的。
大胆地做
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