蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】原核表达做了两个月，没结果

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标题:【求助】原核表达做了两个月，没结果

lagua123[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问一下，有蛋白结构中有跨膜区，对于表达与否的影响会很大吗？
我正为此事发愁呢！
谢谢
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DONT[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
除了诱导条件，第一，先看看是不是稀有密码子的问题，在分子生物学书上可以看到大肠杆菌缺乏的密码子。第二，到网上预测一下你的蛋白,是不是膜蛋白,它的二级结构，定位在什么地方。网站cuturl('http://ca.expasy.org')

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请教，如果是膜蛋白有什么特别的么，谢谢
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DONT[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有请教，GST系统表达的全部是可溶的么，会有包含体么
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lxh031[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
融合表达稀有密码子无影响？不知有无文献证明？本实验室表达一个11kDa的蛋白，在多个载体不能表达（包括pGEX,GST融合, 碳端），经改造后在同一pGEX载体里表达。

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不好意思，我确实没有看到有关稀有密码子对融合表达的影响，只是偶尔看到靠近5‘端的稀有密码子（或稀有密码子簇）对蛋白的表达有很大影响（Emanuel Goldman1，J. Mol. Biol. ，1995， 245：467–473）以及大量的优化密码子偏好后蛋白表达提高的例子（Claes Gustafsson, Sridhar Govindarajan and Jeremy Minshull，TRENDS in Biotechnology ，2004，22（7）：346-353）。不过我还是认为外源蛋白在大肠杆菌中能否表达与很多因素有关。如果考虑到稀有密码子的问题，除了如alishang所讲改造目的基因外，也可以选用表达携带稀有密码子tRNA的菌株，Stratagene,Novagen好象有。
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有请教，GST系统表达的全部是可溶的么，会有包含体么

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GST系统表达的蛋白不一定是可溶的，出现包涵体的现象是常有的事，这时往往纯化很难。这也是His融合可以克服的优点。
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
自己也做膜蛋白,一直没有表达.我知道膜蛋白做原核表达,难度挺大,因为它会整合到细菌膜里面,即使有表达,也很难拿到蛋白.
据我所知,如果你的蛋白不是可融性蛋白会形成包涵体,与质粒应该没什么关系.
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lagua123[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那么请教一下一般膜蛋白是怎么拿到的呢
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
人多力量大啊，集思广益！谢谢各位的宝贵提议。我的这个分子中，稀有密码子没有连续的，分布于第2个（T），第五个（s），8，15，19，24，25，31，32，35，47，48，50，53，62，65，66，总共81个氨基酸。要改造还不知道怎么作？请alishang 教教，融合PCR怎样作的？至于IPTG应该没有失效，实验室其他人都是用的这。不过我的GST是表达有的。而且我还发现一个现象，未诱导的细菌量比诱导的要少多了，培养和诱导时间都是一样的啊？但有人说IPTG对细菌生长有毒性，诱导的细菌长的慢，真搞不懂咋回事？

1、用Novagen的RosettaBlue（DE3）表达菌株可提供稀有密码子tRNA；
2、你的目的基因产物可能对表达菌有毒性，Invitrogen的带PL启动子的载体pLEX可允许毒性蛋白在大肠杆菌中表达。
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
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我现在放弃用原核表达拿蛋白了,我还不知道用什么方法可以拿到,但即使理论上可以,难度也很大.我现采取这样的方法:在跨膜区域之外的片段上设计引物,避开跨膜区.如果还是拿不到,就准备合成多肽.
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lagua123[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yueban-1147 于 2013-7-30 17:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
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我现在放弃用原核表达拿蛋白了,我还不知道用什么方法可以拿到,但即使理论上可以,难度也很大.我现采取这样的方法:在跨膜区域之外的片段上设计引物,避开跨膜区.如果还是拿不到,就准备合成多肽. ...

那么请问，如果是做真核表达膜蛋白有没有可能蛋白表达在转化的真核细胞表面呢？
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