小中大先生不敢當。我也會有出錯的時候。 大家一起討論﹐相互學習。
1. 你是指方法上可行與否﹐還是指真核生物蛋白在原核生物中表達後會其結構是否
發生改變而失真?
方法上是可行的。這有個前提﹐蛋白是可以自我自動折疊的(但有時也要伴侶
的協助)。我現在做的蛋白都是人類蛋白﹐基本都是用Ecoli表達折疊成功的。MBP對
蛋白的折疊效果比GST好。但是﹐如果蛋白涉及表達後修飾話﹐Ecoli不一定合適﹐
你可以用Yeast(我沒做過) 或者insect cell(我做得不多)來表達﹐而insect cell
的表達量比不上Ecoli的﹐而且所用營養基貴。一般來說﹐若果在Ecoli中只能得到
包涵體﹐沒辦法用tag來解決水溶性的問題﹐我才會考慮用insect cell。 如果表達
的是膜蛋白﹐在純化時﹐可利用表面活性劑來提取。
你可能擔心結構會改變。蛋白是自動折疊的﹐而且它的結構已經由其序列決定
了(現在就有人在做從蛋白序列預測其三維結構的理論計算研究)﹐在原核中表達得
到的結構跟在真核中得到的不會有什麼差別﹐關鍵是可否折疊可溶。
2. 你可以留histag 在上面﹐也可切除。有時候﹐histag並不影響結晶。我記得我
第一個蛋白晶體就是沒有切掉histag的﹐在N- 端﹐而且有20個多餘的雜氨基酸。也
有人做過﹐留histag做晶體篩選時﹐沒有結晶﹐把histag去掉後﹐能得到晶體。一
般來說﹐histag對X-ray衍射沒有影響﹐得到的結構是看不到histag的﹐在晶體中﹐
每個蛋白單體上的histag的取向是雜亂的。 histag 對結晶的影響是沒有定論的。
在做蛋白結晶時﹐不要預設定論﹐除了些大概流程原則。
如果你想將蛋白弄乾淨點﹐也可每次都切掉histag。你要用thrombin?還是TEV?
