小中大其實我還是喜歡站友或者網友這個稱號﹐呵呵。
1. 你的蛋白多大? 要是不大﹐沒必要將histag放在C端。 既然用腸激脢後﹐不留雜
氨基酸﹐這挺好﹐沒必要再考慮更換載體了。
其實有時候﹐可以將特定的脢切部位設計到引物中﹐沒必要使用商業化載體自
帶的脢切位點。例如在BamHI後加入TEV序列﹐然後目的序列﹐這樣脢切後在N端只剩
兩個雜氨基酸。
2. 一般來說﹐純度要求95%以上。但是﹐也並非必須如此﹐有時候﹐70 ~80%的純度﹐
可以長出蛋白晶體來。有時﹐純度達到95%以上了﹐也長不出晶體。一般來說﹐越純
越好。如果你想拿過histag柱子後的蛋白來做篩選﹐是可以的﹐但我不主張這麼做。
過完histag柱後﹐可以走離子交換柱﹐最好還過size柱子﹐這樣可以保證高純度(不
僅僅局限于SDS-PAGE的純度)。
3. 應該除去咪唑﹐可用透析。也可在進行離子交換之前﹐用無鹽buffer稀釋一下histag洗
脫夜﹐一般就是2~3倍(我曾經不稀釋﹐就帶300mM的咪唑直接上柱﹐掛柱效果不好﹐
後來就稀釋嘗試)﹐但是有個問題﹐這樣會導致離子交換的上樣量大﹐操作起來也麻
煩﹐時間長。若用透析﹐也要至少耗幾個小時透析﹐但這時﹐上離子交換柱﹐效果肯
定好。後來﹐就看我心情了﹐想用那個途徑就那個。
4. 結晶時所用的蛋白buffer問題是比較大的話題。這裡涉及到蛋白的homogeneity與
穩定性問題。現在比較通用的也是用篩選的辦法來挑選一個或者幾個來嘗試, 我另外開貼說明。但要等一兩天。
