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标题:【求助】我的β-actin出好多杂带~~怎么办？

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发表于 2013-8-3 10:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】我的β-actin出好多杂带~~怎么办？

本人现在在做小鼠的肝组织的western blot，但在做内参β-actin出好多杂带，从来都没碰到这种情况，而且每次显影在55KD附近出现一条很亮的带~~怎么会出现这多的杂带啊~~盼高手能帮我解答，，不胜感激，，

我用的β-actin抗体的santa的，二抗是KPL的山羊抗小鼠HRP,封闭用的是5%脱脂奶粉（TBST含0.1%吐温-20）在37°C封闭1h，一抗稀释是用封闭的牛奶，一抗稀释比为1:1000，一抗孵育条件是4°C过夜，洗脱一抗是用的TBST（含0.1%吐温-20）4*5min，二抗稀释比是1:4000，洗脱二抗用TBST5*5min

盼高手能帮我解答，，不胜感激，，！~！！！！急急急~~！！！
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98776langtao[使用道具]
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发表于 2013-8-3 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
55kd的带是重链，小鼠的组织样品里面含有很多的IgG，就会和鼠的二抗反应，最好用兔抗的actin来检测，或者从50kd左右剪开膜，只压下面的43kd的actin。
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2013-8-3 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们实验室一般做的是43KD的actin。
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发表于 2013-8-3 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

2抗浓度再稀释低点吧，或者吐温多加点
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发表于 2013-8-3 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一抗的稀释比例太高了，内参一抗1:3000以上
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发表于 2013-8-3 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有一种可能就是一抗的问题：不是很特异。CST家就很好，Abart家的也不错
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发表于 2013-8-3 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人现在在做小鼠的肝组织的western blot，但在做内参β-actin出好多杂带，从来都没碰到这种情况，而且每次显影在55KD附近出现一条很亮的带~~怎么会出现这多的杂带啊~~盼高手能帮我解答，，不胜感激，，

我用的β-actin抗体的santa的，二抗是KPL的山羊抗小鼠HRP,封闭用的是5%脱脂奶粉（TBST含0.1%吐温-20）在37°C封闭1h，一抗稀释是用封闭的牛奶，一抗稀释比为1:1000，一抗孵育条件是4°C过夜，洗脱一抗是用的TBST（含0.1%吐温-20）4*5min，二抗稀释比是1:4000，洗脱二抗用TBST5*5min

盼高手能帮我解答，，不胜感激，，！~！！！！急急急~~！！！！

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我觉得你换个奶粉，或者在奶粉里加上点BSA封闭1.5-2h试试！
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发表于 2013-8-3 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
~~怎么会出现这多的杂带啊~~

可以考虑
封闭4°C过夜，封闭液用5%BSA（TBST含0.05%吐温-20），一抗稀释用0.5%BSA（TBST含0.05%吐温-20），一抗一抗孵育条件室温2h，洗脱一抗用的TBST（含0.05%吐温-20）20min摇床上洗两次，再用TBS（不含吐温-20）摇床上洗一次，洗脱二抗同样条件。这样做可以很好的解决杂带和高背景等问题。

注：TBST及TBS一定要足量，膜放在大平皿中洗涤，TBST及TBS配方：

TBS每2000mL(pH7.4)：NaCl 16g

KCl 0.4g

Na2HPO4.12H2O 7.25g
NaH2PO4.2H2O 0.48g
TBST在TBS基础上加0.05%的Tween20。
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发表于 2013-8-3 10:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做的是人的组织，actin是兔抗人的，santa，其它条件和你几乎一样，二抗1:3000,KPL，也是在55KD处条带特别明显，43KD条带比较细。
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发表于 2013-8-3 10:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用小鼠做的抗体确实是IgG含量会高，55KDa的条带很可能是重链的条带，用兔抗鼠的二抗试一试，可能会好些，我也出现过相同的现象。
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