【讨论帖】Western blot省钱大攻略 - 经验共享

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标题:【讨论帖】Western blot省钱大攻略

toy[使用道具]
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发表于 2013-8-3 16:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

前面几位站友提的建议十分中肯，受益匪浅！
我再补充一点：在进行PBST洗非特异性条带的时候大家用什么样的盒子？我用的是包96孔板的塑料盒，这样既环保又省液体。
以前用过150mm培养皿，但是觉得没有该塑料盒方便。
再附上一张96孔板的塑料盒：

附件

2013-8-3 16:16

64034336.snap.jpg (68.95 KB)

DNA[使用道具]
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发表于 2013-8-3 16:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

也说下我们做wb的经验
1 提蛋白还是买成品的裂解液，国产的就行，1ml也就1块左右，效果一般好过自己配的
2 各种液体配置成高浓度的储备液，4度储存，前一天配好胶，4度过夜，第二天跑，加预染marker。电泳内液换新的，外液回收（一周），转膜液提前配置（消泡沫），不回收。
3 切胶转膜的时候依据marker条带，都用尺子量一下，NC膜还比较省
4转完立春红染一下，不过染不出来也不一定没有。立春红可以配成10*放起来，室温就行。1*工作液也可以反复用
5封闭用的奶粉可以用试剂公司的那种，比超市买来可以喝的那种好些，浓度也不用太大，5%就成
6孵育抗体的时候用过手套、自封袋来裁成和膜大小相称的小袋，也用过封口膜反贴，没回收过抗体。感觉要是说省还是反贴，不过要是一次做很多个样，然后膜比较长，冰箱里面不平可能效果就会比较差，一般就是有几个泳道的出不来，不过预试还比较省，条件摸差不多了再封袋子
7定影显影都买的是特便宜的照相馆用的那种，1L七八块，配好了都放在棕色瓶里，临用前倒出来，用完回收，定影用的久些，显影差不多也可以用三四周

applebook=213[使用道具]
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发表于 2013-8-3 16:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主的话题很好，但结合我的经历，省钱还要考虑试验结果。我来谈谈我的western blotting省钱而又保质的经验：

1、一抗反复回收利用，至少2周。抗体的费用应该来说是WB中耗费最大的，我们日常试验中通过使用专用的抗体稀释液（内含防腐剂和蛋白稳定剂），同时每次牛奶封闭后用PBS充分浸洗后放入一抗液体中，否则会因为牛奶变质而使一抗提前失效。

2、二抗亦可反复利用。建议用PBS稀释，不用牛奶稀释，因为牛奶容易变质而影响抗体的特性。

3、PVDF膜的反复利用做同一样品中的多种抗体。我们课题组最多做过6种抗体（用同一张膜），效果很好的。两次之间需要用抗体去除液（如碧云天）孵育，抗体去除液也可反复多次使用。

4、发光剂的巧用。每次根据mark的位置，估计到目的蛋白的可能位置范围，直接对着目标位置涂发光剂，十分省试剂，尤其对大膜。进口的发光剂10ml包装的1000元左右，太贵了。

以上观点，仅供参考。若经费充足的话，建议还是保证质量的前提下，再考虑如何节约试剂，尤其是珍贵的样品。

阿敏[使用道具]
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发表于 2013-8-3 16:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

问一下，你的那个盒子是什么盒子，买的哪里的？可否告知。我觉得我们实验室用的盒子太大，每次用起来太烦！

utt0989[使用道具]
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发表于 2013-8-3 16:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

说下我们实验室的两大妙方呵呵
1 用胶片子制作抗体盒子，有时候显影没成功的胶片或者曝光的废弃胶片都可以用来做这种胶片盒子。根据膜的大小来做，几个角用胶水粘下，方便又好用，关键是省抗体，每次只要2ml左右的一抗
2 分子量相近的可以重复显影，一个蛋白显影结束后，我们将膜用1%0，就是千分之一的NAOH，每次5min×3次，再用TBST洗5min×3次，然后将膜放另一个一抗过夜，效果很好，我们也不买stripping buffer。这种方法我们一直在沿用，效果不错。

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发表于 2013-8-3 16:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

进行SDS-PAGE电泳时，我用的是伯乐MP3系统，内槽电泳缓冲液一定要超过最低的挡板，外槽的电泳缓冲液是槽子的一半就可以了，这样可以节省电泳缓冲液，前提是内槽的电泳缓冲液不外漏。

youyou99[使用道具]
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发表于 2013-8-3 16:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

WB可以先配好4*的母液，用时直接加AP和TEMED还有DDW就可以，这样一次同时加6到8块板子都没问题，另外二抗是可以回收利用一到两次的。
至于膜的重复利用，个人经验不支持，那个洗膜液太酸，对条带还是有影响的

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发表于 2013-8-3 16:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

支持一下楼主和楼主们的好建议，收获不少，我也补充几点好了

1、一抗二抗都可以回收的，抗体价格不菲，如果每次先用现配也代价太高，当然看各个实验室的条件，回收后如果一直用住，则4度保存1-2周，如果暂时不用可-20度保存，以作抗体不足时的备用。
2、有机会就可同时做几个蛋白，分子量相近的，可以同时跑胶，小分子量的蛋白注意把握时间，不要跑过头，内参不必加二抗，不同蛋白如果二抗应用的是相同的那就方便了
3、转膜的PVDF膜建议充分利用，特别是蛋白条带少的时候，能为实验室节约一点是一点啊，切膜的时候注意边角料的再利用
4、一张膜做蛋白和内参一起，条带相近时可以试着平切膜，聪明的话两端各放一个Marker可以校正水平程度，如果胶跑得不平整不推荐使用。
5，显影液可以倒在玻璃板上，依照膜的大小抽吸配比，第一次显影若是曝光过于不理想，可以将膜重新洗过再利用来显影，大多有效，Strip以后的膜显影已经打折，所以争取把握住第一次刚跑出来的才好！

tie8[使用道具]
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发表于 2013-8-3 16:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

再后续补充一点，牛奶配的若干抗体中，为了防止长菌变质，可以加入少量叠氮钠，还是蛮有用的！

windy+++[使用道具]
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发表于 2013-8-3 16:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相比较而言，我们实验室的条件可能要好一些。我们用的是LI-COR's Odyssey Infrared Imaging System 。我们实验室的记录是一条膜连续显色4次，外加最后一次常规显影，共检测了5种蛋白，是一位资深的师姐做的，抗体全部是回收使用的。这种方法适合检测那些分子量相近的蛋白，图片的质量很好。

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