小中大从标准曲线可以看出: r2=0.9995,大于0.98,标准差都在0.2范围内,而E=10-1/-3.2013=2.04,扩增效率=(2.04-1)×100%=104%,表示定量准确,可将未知样品的Ct值带入方程:
23.36667= -3.2013 X + 30.827 可得X=2.33
所以copies=(5×104/2) ×2.33=5.825×104
但我们需要注意的是,标准曲线只可能用于推算稀释梯度范围内的未知样本的量,而不能外推稀释梯度外的未知样本的含量。所以,我们在实验过程中尽可能使未知样品的浓度在标准品的稀释范围内。
5.2相对定量分析方法
5.2.1相对定量分析方法的使用条件
同绝对定量分析类似,我将举例来说明我们在实验过程中何种实验需要用相对定量来进行分析。我们如果想知道经过药物处理过的组织和未处理的组织中某一目的基因的表达水平是否有差异,相差多少倍?我们可以选择以下2种方式:
1)我们可以从等量的2种组织中提取RNA,分别进行目的基因的反转录特异性荧光定量PCR实验来确定目的基因在2种组织中的表达量,结果可以反映等量的2种组织中目的基因表达量的比率。
2)如果我们之前已经确定2种组织中看家基因如GAPDH的表达量相等,那么,我们就可以从大约等量(不需要等量)的2种组织中分别提取RNA,通过RT-qPCR实验来确定2种组织中目的基因和看见基因的表达水平。药物处理组织的目的基因的表达量可由2种组织中看家基因和未处理组织中目的基因的表达量共同来确定。
2种分析方法的差异就在于用的标准有所不同,方法1)中的标准是2种组织的量相等;方法2)中的标准是2种组织中看家基因如GAPDH的表达量恒定不变;