蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】提蛋白时细胞很粘稠怎么办?

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

标题:【求助】提蛋白时细胞很粘稠怎么办?

mamamiya[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72974
精华 0
积分 653
帖子 986
信誉分 100
可用分 5763
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
11
 

貌似没有合适的解决方法啊?
顶部
mamamiya[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72974
精华 0
积分 653
帖子 986
信誉分 100
可用分 5763
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
12
 
超声以剪切基因组,就不发粘了,提取跨膜蛋白(能尽量保留生物活性的)可以用以下试剂盒

===============================================

同意,建议超声,以打碎基因组;或者使用不含SDS的裂解液
顶部
ukonptp[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 103464
精华 5
积分 796
帖子 992
信誉分 110
可用分 5846
专家分 50
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
13
 

我们实验室从美国回来的教授改进了实验方法,提蛋白时很好用。

以六孔板为例,一般从培养箱取出后弃去培养基,用预冷的PBS洗或不洗,之后整个过程均在冰上进行。

取150ul/孔裂解液(RIPA:PMSF=100:1),一般在冰上震荡5分钟左右后就可离心12000g,20-30分钟后取上清,细胞碎片和核酸等即可浓缩沉淀在管底,一般是很少有胶状物质的的,LZ可以试试
顶部
DDD[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73222
精华 1
积分 587
帖子 790
信誉分 102
可用分 4768
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
14
 
SP!

&, 如果不需要核内蛋白,裂解时间短一些,比如5min, gDNA就很少。
顶部
kuohao17[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77299
精华 0
积分 559
帖子 716
信誉分 101
可用分 4453
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
15
 
我们实验室从美国回来的教授改进了实验方法,提蛋白时很好用。

以六孔板为例,一般从培养箱取出后弃去培养基,用预冷的PBS洗或不洗,之后整个过程均在冰上进行。

取150ul/孔裂解液(RIPA:PMSF=100:1),一般在冰上震荡5分钟左右后就可离心12000g,20-30分钟后取上清,细胞碎片和核酸等即可浓缩沉淀在管底,一般是很少有胶状物质的的,LZ可以试试

=========================================================================================================

一 般 在 冰 上 震 荡 5 分 钟 左 右 后 就 可 离 心 12000 g ,20-30 分钟 后 取 上 清?
不 好 意 思,因 为 明 天 第 一 次 提 取 蛋 白,所 以 不 太 明 白,看 到 很 多 资 料 都是 说 冰 上 裂 解 30min,然 后 再 12000 rpm,离 心 5min。
所以想问下,我 要 提 取 的 是 人 贴 壁 肿瘤 细胞株 的 全蛋白,应该是选择前者还是后者呢?
顶部
woshiduiyan[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108875
精华 1
积分 207
帖子 89
信誉分 102
可用分 1154
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
16
 

粘稠物就是DNA啊,你可以最高速离心半小时到一小时,取上清。也可以加适量DNase,超声等办法。如果你做免疫共沉淀,并且蛋白相互作用可能RNA依赖,就不要用超声了,免得破坏RNA造成假阴性。
顶部