蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】酵母双杂交 实验流程问题 请多指教 ！

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 33  2/4 ‹‹1234››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】酵母双杂交 实验流程问题 请多指教 ！

langlang[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77033
精华 0
积分 668
帖子 976
信誉分 100
可用分 5741
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
11

发表于 2013-8-16 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也正在做Mating，同路人，给你一些建议：

1. 个人认为在做酵母双杂交时，目标要明确，紧盯最后的测序结果，这是你的最终目的。所以实验在做熟后，不要在某一步停留耽误时间，双杂只是整体实验方案中的第一步，找到兴趣基因后，后续的一系列验证实验才是关键。

2. 在你的实验中，先关注那11个克隆。菌落PCR的条带大小相同，不见得就是一个东西；可以把PCR产物进行酶切，看是否酶切后的条带也相同。然后把不同的克隆拿去测序看看（其实都拿去测序也不是不可，就看实验室能否承受了，毕竟测序的钱在整个实验中的比例不算大），看测出的序列是否为基因的编码序列及读码框在AD载体上是否正确（这两点都很重要）。如果有比较好的结果就马上着手进行后面的实验了（pull-down、co-IP等）。

3. 至于其他的候选结果可以慢慢验证。首先你的X-gal assay的结果其实不能说明问题，毕竟是两次非平行操作，有误差是正常的，只是你的误差确实大了点；在我的实验中反倒是通过X-gal能排除的克隆并不多，大概80-90%都变蓝；建议PCR、酶切分组后，选一些先去测序。再次共转化涂QSD平板是对的，同时做单转化AD涂QSD也是需要的（验证AD的自激活，不过基本上AD自激活的情况不多）；找到兴趣候选蛋白后互换载体共转化验证也可以（即AD-bait、BD-prey，共转化涂QSD平板及X-gal assay；当然是在时间允许的情况下可以选择做这步，但要是克隆做的不熟就算了，费时间）。基本上在酵母中的验证实验就这些了，如果有好的结果就先恭喜一下了。

4. 还有几点对于后面实验的小提示。首先筛到得基因很可能不是基因全长，如果序列包含该基因的重要结构域，可先不着急拿到基因全长，继续进行后续实验即可。同一基因在众多候选克隆中出现的次数越多，则可能性越大。找到兴趣蛋白后，体内体外的验证实验（在实验室系统成熟的情况下）应该比较顺利才对，侧面反映二者互作的可能性很大。构建载体时可添加tag，使用标签抗体便于节省时间和经费，得到较好结果后，再扩增基因全长、购买抗体（当然经费允许则另当别论）。

总而言之实验要同时开展，边找边做，找到一两个并能做出结果就相当好了；可能叙述过程中有不妥或错误的地方，还请见谅，祝实验顺利。
顶部
=pkchen=[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108889
精华 0
积分 240
帖子 160
信誉分 100
可用分 1612
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
12

发表于 2013-8-16 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感谢各位的经验之谈。。。

感觉，心里有底了。

等待的测序结果终于出来了，，，可是，DAN纯度低，，没有测出来。。。

PCR产物，直接作的测序。

因为等不及 PCR product purification Kit,,,,,,用的是gel elution kit。

结果，DNA 纯度非常差，siquencing 根本读不出来。

只能等了。
顶部
=pkchen=[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108889
精华 0
积分 240
帖子 160
信誉分 100
可用分 1612
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
13

发表于 2013-8-16 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有，我用其他的一个 Bait 按照上述的方法，

现在已经做到了QDO , X-a-gal filter assay.....

奇怪的是，这次很成功，在TDO上长了密密麻麻的好多菌落。

在 QDO上 竟然在 mating 后的第6天，就长出了 100多个克隆。
没想到，Bait的种类不同，Y2H的结果会有这么大的差别！！！

现在，将 这 100多个克隆，重新 划了一次 QDO 2天就长满了。

X-a-gal filter assay也是 90%以上，都变蓝了。。。

今天，刚在 QDO+X-a-gal plate上，划了一遍。。。
等它也变蓝了，是不是就可以直接都测序阿。

我们教授，让我把所有的 TDO都扔了。。说是 QDO上面的意境足够了。

我至今，已在 QDO上选出了 近 300多个克隆。。

希望 各位，，给予点评！！！

谢谢！！
顶部
cwcwcww[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 101434
精华 1
积分 311
帖子 277
信誉分 102
可用分 2191
专家分 10
阅读权限 255
注册 2012-12-3
状态 离线
14

发表于 2013-8-16 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感谢各位的经验之谈。。。

感觉，心里有底了。

等待的测序结果终于出来了，，，可是，DAN纯度低，，没有测出来。。。

PCR产物，直接作的测序。

因为等不及 PCR product purification Kit,,,,,,用的是gel elution kit。

结果，DNA 纯度非常差，siquencing 根本读不出来。

只能等了。

============================================

从酵母中提取后，可以转化大肠杆菌，然后再提取，测序。
顶部
cwcwcww[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 101434
精华 1
积分 311
帖子 277
信誉分 102
可用分 2191
专家分 10
阅读权限 255
注册 2012-12-3
状态 离线
15

发表于 2013-8-16 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有，我用其他的一个 Bait 按照上述的方法，
现在已经做到了QDO , X-a-gal filter assay.....

奇怪的是，这次很成功，在TDO上长了密密麻麻的好多菌落。

在 QDO上 竟然在 mating 后的第6天，就长出了 100多个克隆。
没想到，Bait的种类不同，Y2H的结果会有这么大的差别！！！

现在，将 这 100多个克隆，重新 划了一次 QDO 2天就长满了。

X-a-gal filter assay也是 90%以上，都变蓝了。。。

今天，刚在 QDO+X-a-gal plate上，划了一遍。。。
等它也变蓝了，是不是就可以直接都测序阿。

我们教授，让我把所有的 TDO都扔了。。说是 QDO上面的意境足够了。

我至今，已在 QDO上选出了 近 300多个克隆。。

希望 各位，，给予点评！！！

谢谢！！

=====================

有排除诱饵的自激活么？
顶部
=pkchen=[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108889
精华 0
积分 240
帖子 160
信誉分 100
可用分 1612
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
16

发表于 2013-8-16 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有排除诱饵的自激活么？

========================================================

在 早先，，做 Bait transformation的时候，曾作过的。

当时，做的是 将 GBKT7 - Bait 转入 Y187...

之后 在，， SD/-Trp/X-a-Gal..SD/His/-Trp/X-a-Gal... SD/-Ade/-Trp/X-a-Gal...

上都涂抹过，，，当时都没有呈蓝色。

而且，只在 SD/-Trp 生长。。

应该算是 没有自激活吧。
顶部
=pkchen=[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108889
精华 0
积分 240
帖子 160
信誉分 100
可用分 1612
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
17

发表于 2013-8-16 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
从酵母中提取后，可以转化大肠杆菌，然后再提取，测序。

=======================================================

两手都在准备。。 PCR purification kit 结果看得更快一些。。

这次，为了保险起见，已经做液体培养了，大概明天晚上 提取质粒。
在转染 E.coli。

我的 Kit 说明书上说，
要是 Bait 和 library 质粒， 各自的 antibiotics marker 不同的话，
就可以直接 转入 普通的 DH5a E.coli菌系。。
如果相同，就必须转入 KC8 E.coli。

我的 library和 bait 分别为 Kana+, Amp+，，
那是不是就说，我只要在 yeast提取出来质粒，就可以用普通的方法。

input DNA --> ice 5min--> heat shock 42度 90s --> ice 5min --> plating

转入 通的 DH5a E.coli菌系，液体培养+ antibiotics
再用一般的 质粒提纯kit 提取质粒DNA，测序。对么？？
顶部
xyw5[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75137
精华 1
积分 620
帖子 815
信誉分 102
可用分 4991
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
18

发表于 2013-8-16 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是的，毕竟酵母里面质粒复制不如细菌快啊。

个人建议，仅供参考。
顶部
=pkchen=[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108889
精华 0
积分 240
帖子 160
信誉分 100
可用分 1612
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
19

发表于 2013-8-16 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不过，现在想想，当初做 自激活 验证实验的时候，

用的 X-a-gal 是溶解后 6个月左右的时候。活性好像不是特别好。。。

当初，是借别人的 用的。

借给我的人，说是 他上个月作过 X-gal asssay，显色没什么问题。

我不会那么惨吧~~

自激活，没有变色，是不是跟当初的 X-gal的活性降低，也有关系呢？？？

您一提起自激活， 我怎么突然打了冷颤。。

10分钟前，将 bait 划到了新的 X-gal plate上。
顶部
ukonptp[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 103464
精华 5
积分 796
帖子 992
信誉分 110
可用分 5846
专家分 50
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
20

发表于 2013-8-16 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 =pkchen= 于 2013-8-16 15:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不过，现在想想，当初做 自激活 验证实验的时候，

用的 X-a-gal 是溶解后 6个月左右的时候。活性好像不是特别好。。。

当初，是借别人的 用的。

借给我的人，说是 他上个月作过 X-gal asssay，显色没什么问题。

我不会那么 ...


呵呵，有时候结果太好了，也会下意识的去怀疑，做实验，有时候就是自己折磨自己，然后求得解脱的过程。
顶部
 33  2/4 ‹‹1234››