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标题:【求助】酵母双杂交 实验流程问题 请多指教 !

INK[使用道具]
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21
 

将来会怎么样,交给阿拉去。自己做好当下的工作。实验就是充满了可变性。无需担心明天的实验结果,先生活好才最要的。
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以平常心面对,,尽我所能吧。

可能是因为 第一次接触yeast做Y2H, Y2H实验量又是这么的庞大。。

期待的,付出的,比起其他实验多的缘故吧。

心疼~~~

不过,大家这么热心帮忙,给了我很多动力。。

感谢 HaveNoMoney,shashababy,wlei211, havocking,feiflyfei888,各输己键,各位热心的解答!!!!!!

今后,有什么不明白的,不免还会麻烦各位!!! 呵呵~~

谢谢!!!
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sequencing 结果出来了。。。

我的 两个 bait的实验结果

1号 bait---->

共 45个当中,
6个 G protein,
2个 cathepsin D,
5个 GAPDH,
3个 Actin,
1个 cathepsinL

2号 bait --->

45个 都是 NM_010240.2 Mus musculus ferritin light chain 1 (Ftl1), mRNA

其他的sequencing 正在进行中
用的是 同一个Library...... 怎么回事呢??
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看大家讨论甚欢,本人不胜羡慕。俺是一名即将要做酵母双杂交的新手,十分遗憾还看不懂各位高人的发言,俺在此蒙住头问问各位前辈:请问这个实验怎么入门?可以从哪些方面入手还了解,身边很少人做这个实验的,十分苦恼,无奈老板委以重任,本人终日惶恐,唯恐不能胜任。还请各位指点迷津!十分感谢!
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25
 
sequencing 结果出来了。。。

我的 两个 bait的实验结果

1号 bait---->

共 45个当中,
6个 G protein,
2个 cathepsin D,
5个 GAPDH,
3个 Actin,
1个 cathepsinL

2号 bait --->

45个 都是 NM_010240.2 Mus musculus ferritin light chain 1 (Ftl1), mRNA

其他的sequencing 正在进行中
用的是 同一个Library...... 怎么回事呢??

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ferritin、MT2A一些专家认为属于假阳性的靶蛋白,具体文献2000年前后有解释。

前面的45个测序结果,可以结合你的诱饵蛋白进行分析,决定是否进行下一步实验。

个人建议,仅供参考。
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hustwb[使用道具]
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看大家讨论甚欢,本人不胜羡慕。俺是一名即将要做酵母双杂交的新手,十分遗憾还看不懂各位高人的发言,俺在此蒙住头问问各位前辈:请问这个实验怎么入门?可以从哪些方面入手还了解,身边很少人做这个实验的,十分苦恼,无奈老板委以重任,本人终日惶恐,唯恐不能胜任。还请各位指点迷津!十分感谢!

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如果老板只是感兴趣,不愿意拿出4-6万让你来完成这个实验的话,可以考虑早点换课题。

类似的例子遇到已经很多了,甚至一些朋友连诱饵载体都构建好了,也转化了,但是老板不愿意拿钱买文库或者其他相关的试剂,中断的不少。

仅供参考。
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27
 

我这里有个有意思的现象,我有一个基因,只编码36个AA
但是不论连接在AD,还是BD上,都能自激活。
说明有2个可能
1.这个蛋白本身既有AD又有BD功能。不过似乎不太可能,现在报道的转录激活因子中,没有小于100AA的,这个太猛了。
2.能激活转录复合物的产生。不确定是光谱,还是专一针对lac-z这个报告基因。正在补充实验,看看能不能激活酵母双杂交的其他营养缺陷。

欢迎大家的奇思妙想。
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yonger[使用道具]
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有查了点综述,发现有类小肽,含螺旋-转角-螺旋结构,有一段碱性肽段,可与DNA结合。小肽间可以同源形成2聚体,也可以异源。进而可引发转录产生。估计我这个东西类似。
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BOSS2011[使用道具]
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看大家讨论甚欢,本人不胜羡慕。俺是一名即将要做酵母双杂交的新手,十分遗憾还看不懂各位高人的发言,俺在此蒙住头问问各位前辈:请问这个实验怎么入门?可以从哪些方面入手还了解,身边很少人做这个实验的,十分苦恼,无奈老板委以重任,本人终日惶恐,唯恐不能胜任。还请各位指点迷津!十分感谢!

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我觉得入门的最好材料就是试剂盒的操作手册,上面从原理到操作,已经都很详细了。先把原理搞明白,再对照原理图看操作流程图,最后看具体的操作步骤。如果还有时间的话可以再找些综述性的论文看看。

想成为高手的话,就要多看资料,多做了,呵呵。
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jkobn[使用道具]
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我马上就要做这个实验了,想请教一下各位,做这个实验之前要准备一些什么东西?是不是只要订一个酵母双杂交的试剂盒就可以了?还要不要订别的试剂盒?另,哪种试剂盒好用一些?谢谢!
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