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标题:【讨论帖】蛋白新纯化思路探讨

DONT[使用道具]
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发表于 2013-8-30 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对于一些同源性比较高的蛋白，比如我在大肠杆菌里面表达一个酵母的DNase，或者直接就是大肠杆菌的DNase，很可能就会挂到你的抗体柱上。这种方法个人认为特异性不高，而且单一的抗体—抗原结合只是最理想的情况，柱子上这么多种抗体，说不定有那个就和你的目的蛋白有其他的相互作用（比如疏水、离子键等）。
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发表于 2013-8-30 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 DONT 于 2013-8-30 15:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

对于一些同源性比较高的蛋白，比如我在大肠杆菌里面表达一个酵母的DNase，或者直接就是大肠杆菌的DNase，很可能就会挂到你的抗体柱上。这种方法个人认为特异性不高，而且单一的抗体—抗原结合只是最理想的情况，柱子上这么多 ...

单一的抗体—抗原结合只是最理想的情况，这个我倒是没有想到 谢谢
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发表于 2013-8-30 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
觉得这个想法非常好，但是目前很难实施
一个是比较复杂，成本高，需要寻找更简便的方法
一个是纯化的纯度，只有理论上是成立的
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standbyme[使用道具]
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发表于 2013-8-30 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得楼主钱烧不完的话不如把序列给公司，几周就能拿到你要的东西了，而且比你的想法省钱
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hold住[使用道具]
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发表于 2013-8-30 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

sepharose载量有限，一般破菌上清中杂蛋白起码占80%以上，要将每一种杂蛋白都挂住，那每个抗体需要挂多少在sepharose上？而且是每一个抗体都要有这么多的量，那总体来说这个sepharose上要挂多少蛋白？或者你可以加大填料的量来解决这个问题，但这个量将非常巨大。
而且蛋白纯化除了去除杂蛋白外，还有核酸、色素、多糖等很多成分要去掉，现有的Ni柱基本可以去除这些成分，但抗体柱可能就不行了。当然也可以通过后续的纯化去除，但如果大批量做的话，第一步的抗体柱纯化起不到浓缩样品缩小样品体积的作用，后面的离子交换还是凝胶过滤做起来就比较麻烦了
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发表于 2013-8-30 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 hold住 于 2013-8-30 15:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

sepharose载量有限，一般破菌上清中杂蛋白起码占80%以上，要将每一种杂蛋白都挂住，那每个抗体需要挂多少在sepharose上？而且是每一个抗体都要有这么多的量，那总体来说这个sepharose上要挂多少蛋白？或者你可以加大填料的量来 ...

谢谢你的提醒 困难是有很多的 但是我觉得吧 可以作为一个纯化思路 或许不一定适合这个案例 但有可能其他方面有意义
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youyou99[使用道具]
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发表于 2013-8-30 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

过程有些复杂，成本高
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mickeylin[使用道具]
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发表于 2013-8-30 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主主要想利用这种手段开发一种类似于protein A捕获抗体的通用平台技术，我同意3楼的意见。个人认为这种混合抗体柱子可能有各种意想不到的情况发生，使得该步层析无法超越或接近常规纯化介质的效率。
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duoduo[使用道具]
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发表于 2013-8-30 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

总觉得有点大炮打苍蝇的感觉，或者用一些很复杂的方法去合成乙醇的感觉。难道不能直接用目标蛋白的抗体（利用相似已知蛋白来制备的）来纯化吗？
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baidukk[使用道具]
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发表于 2013-8-30 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

其实我也觉得这个想法不切实际，哈哈，楼主不要骂我哈，不过这个逆向思维是值得欣赏的
1 你用一个及其复杂的混合物（既有Ecoli的毒素，又含破碎细胞时用的去污剂，溶解蛋白时用的高浓度尿素或者盐酸胍）去免疫一只兔子，我首先想到的是这只兔子在产生抗体前能否保证活着，在国外估计是不允许拿动物做这种实验的
2 假设兔子活着，整个混合物中成分过于复杂，每种成分的免疫原性参差不齐，肯定会有某些杂蛋白的抗体水平相当低，根据水桶效应，你要去除所有杂蛋白必须保证抗体浓度最低的那个达到一定水平，这个量肯定需要实验来验证，但是肯定很大，绝对比你直接用目标蛋白免疫得到多抗或者做单抗要浪费得多
3 即使得到了所有杂蛋白的抗体，谁也没法保证这些抗体和你的目的蛋白没有交叉反应，就算第一次没有交叉反应，也无法保证每次都没有，也就是说这个实验是没法重复的，如此复杂的混合物中能和你的目的蛋白有交叉反应的可想不在少数，一旦有交叉反应，过柱子的时候必定是干干净净的全部留在柱子上，没有起到纯化的效果
4 做单抗的时候通常都需要筛选效价高，亲和力强的单抗，用这个混合物免疫得到的超级多抗中肯定合格的抗体是少数，最终亲和的效率肯定也达不到要求
这种实验还是建议楼主拿出一个可行的计划再动手，免得浪费时间和金钱，时间和经费多宝贵啊
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