【讨论帖】我在SDS-PAGE中所犯的错误 - 经验共享

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标题:【讨论帖】我在SDS-PAGE中所犯的错误

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发表于 2013-8-31 16:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我这里AP在－20度放置，temed在4度放置，其他在室温放置，基本上多半年无问题。我的体会是，电泳缓冲液很重要，最好用数次就弃去，还有上槽液和下槽液要分开，用几次后，可以将上槽液改为下槽液，弃去下槽液。当然这是针对Bio－Rad这种上下槽分开的系统。

PCR[使用道具]
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发表于 2013-8-31 16:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的AP是分装成小管，放－20保存，每次用一管，印象中半年是没问题的。TEMED是放4C。其它常温放置。另外配制顺序最好是TEMED先加，然后再加AP，因为没有TEMED，AP也可以引发聚合反应，只不过速度稍慢一些，对于学过高分子的人这些最清楚。

zzzz[使用道具]
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发表于 2013-8-31 16:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教几个问题：
1、我的胶凝后总有少量水分析出，是否正常？
2、按照分子克隆配的12％胶20kDa的蛋白跑不出来，且染料的位置有一条深染的条带，只有15％的胶下面条带才消失，我跑的是细菌总蛋白，是否是因为胶的实际浓度低所致？
3、细菌沉淀直接加2×buffer，煮沸5分钟变性，离心后上样，是否可行？为什么有的样品稀，有的样品特浓，上样都困难，跑出来后严重脱尾？
4、哪位高人有蛋白表达方面的经验请指教！x

jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2013-8-31 16:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

琼脂粉可以用作封底胶。我们实验室一直在用！物虽不很美，但价廉！

idea2011[使用道具]
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发表于 2013-8-31 16:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我跑12%的胶，没出现过你说的深带。
我一般是细菌沉淀直接加样品buffer，再加5ul的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，效果还行

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发表于 2013-8-31 16:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1。可用聚丙酰胺快速胶（加大AP和TEMED的浓度）封底；
2。AP -20C分装保存，可至3个月；
3。做好分离胶后，要小心地用水封，避免空气影响胶的聚合；
4。细菌沉淀加1XBuffer，可溶性样品加2XBuffer，煮5min，上样10-20ul；
5。剥胶用Bio-Rad的剥胶塑料板非常方便，用注射器注水冲的方法易搞破胶。

dmg[使用道具]
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发表于 2013-8-31 16:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

琼脂粉可以用作封底胶。我们实验室一直在用！物虽不很美，但价廉！

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CAT，你用的琼脂粉是多大浓度的，我用2%都不能好。

tudou85[使用道具]
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发表于 2013-8-31 16:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用1%的琼脂封胶效果很好，有时候琼脂的质量不同，用的浓度就不同，我们实验室发现即使是同一厂家不同的批次质量都不同，你的琼脂可能质量不好，你可以加大浓度试试。

summerxx[使用道具]
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