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标题:【讨论帖】我在SDS-PAGE中所犯的错误

okhaha[使用道具]
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琼脂粉可以用的,我就是用这个,其实没什么影响的,2%的琼脂粉凝结的很慢,我每次用4%啦,从没出现过漏胶的问题。另外SDS我也是常温放着的,TEMED我是常温避光放置,AP 4度保存。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺不能久置,最好新配。其它的问题也就是熟练而已啦。
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dmg[使用道具]
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最近我在跑SDS-PAGE时,发现胶上部分条带出现山峰状的高耸,有点象心电图的样子。第二个问题是:肉眼看胶的背景很干净,可是用Amersham的
Image Scanner进行凝胶扫描时,调整对比度后却发现有显色比较深的竖条带贯穿在某个样品的蛋白条带上下。请问各位高手这是什么原因导致的?以前丁香园曾有帖子说这是因为存在不溶性蛋白的缘故,可我的样品全都是可溶性蛋白。
我想把自己的“问题”凝胶上传给大家分析,可是我发现可以上传的那个项目好像消失了,所以我不知道该如何让大家看见我的胶。抱歉,只能口述了。
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dmg[使用道具]
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对于大家上述谈到的问题,我也说说自己的体会。
(1)AP我们一般是现用现配,配好后未用完的一般在4度保存一周。一周后的必丢弃。
(2)10%SDS在室温保存一年,感觉也没什么问题。气温下降时可能会出现白色絮状物,当时碰到这个问题,我是把旧溶液丢弃,重新配制。后来我们实验室的技师说,加温溶解后应该还可以用。但本人没试过。供大家参考。
(3)1M Tris(pH6.8)和1.5M(pH8.8)我也放在4度保存,理论上说在室温保存即可。可我们室温保存的Tris曾发现絮状物,我不太清楚什么原因,可能是配置时间太长了?但我感觉放4度保存效果很好,已经大半年了,没有出现絮状物的情况。
(4)TEMED我们是4度避光保存,丙烯酰胺棕色瓶4度保存。理论上,TEMED是易吸湿的无色液体,吸水则加速氧化变成黄色,会降低其增速作用,最好不要用。暂不用者最好密封保存在深冻冰箱中。但我们4度保存的TEMED通常都是黄色的,感觉用起来也没什么问题。丙烯酰胺理论上4度可保存一个月,但我们通常都会超过这个时间期限,可能至少也有2、3个月,也没什么问题,但还是建议大家配制溶液时一次少配点,譬如50ml或100ml。
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dmg[使用道具]
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另外我们实验室用的是Amersham的电泳仪,是用凡士林来封底的。用起来也很方便。
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duoduo[使用道具]
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大家有用5*LOADING BUFFER的吗??配方就是分子克隆的浓缩一下是吗??
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abc816[使用道具]
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为何我跑的胶老是歪的,用的是国产电泳仪
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jkobn[使用道具]
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经验而已,用1.5%的琼脂糖封胶相当好!
当然,其实各实验室都有自己的一套东西,希望大家多交流。俺是新的手啦,不懂的很多。
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mysmdbl[使用道具]
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maker可以放在一测,另外我们做完分离胶后用异丁醇封顶,效果挺好的,不妨试一试
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zzzz[使用道具]
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我最近跑胶感觉积成胶凝的特别慢,分离胶就没有,为什么啊?
而且我跑的Maker最大的一条带要么看不到,要么变成很细的很近的两条带,是怎么回事呢?换了一管新的也是一样!
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00无名指00[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 zzzz 于 2013-9-2 15:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我最近跑胶感觉积成胶凝的特别慢,分离胶就没有,为什么啊?
而且我跑的Maker最大的一条带要么看不到,要么变成很细的很近的两条带,是怎么回事呢?换了一管新的也是一样! ...

胶凝的慢不用说,肯定是试剂的问题,想解决,那就把temed多加2ul,,aps增加10左右,保证快些,另外你的aps建议重赔,此外凝的时候放在37度也会快点。
你的marker其他带怎么样,而且最大的本来就比较浅,出现两条带可能使你跑胶的问题
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