样品前处理

转载
最近在做关于大肠杆菌的实验，但对生物一窍不通，因此请教几个问题。
        我的实验过程如下：在含乳糖的培养基中培养大肠杆菌，目的是诱导大肠杆菌产生β－半乳糖苷酶。随后离心（转速5000），用NaCl溶液清洗菌体，再离心（转速7000），然后用PBS溶液清洗菌体沉淀，得到菌体浊液。然后再往菌体浊液中加入ONPG，ONPG是β－半乳糖苷酶的底物。论文上说，对于大肠杆菌，β－半乳糖苷酶是胞内酶。但在离心分离之后，我往菌液中加入ONPG，溶液很快就变成黄色了。
        所以很困惑：既然β－半乳糖苷酶是胞内酶，为什么ONPG很快就水解了呢？难道是β－半乳糖苷酶能被大肠杆菌很快释放到溶液中？或者离心能使大肠杆菌细胞破裂，β－半乳糖苷酶被释放出来？
       希望能听听高人的意见，能给出意见和建议最好！

这个是生化书上最经典的知识啊，乳糖操纵子啊。

LacZ基因--合成半乳糖苷酶
LacY基因--合成通透酶
LacA基因--合成乙酰基转移酶

三个酶，其中起作用的是半乳糖苷酶，通透酶可以将半乳糖苷酶转移到胞外。
当然，胞内酶也可以少量释放到胞外，这个在研制大肠杆菌培养基的时候仔细研究过，呵呵

即便是胞内酶，在诱导过程中也会被少量的释放，
菌体细胞的破坏死亡也会使得胞内酶释放。
若是冷冻高速离心的话，也会多少破坏细胞结构。
再有PBS多少也有改变细胞通透性的作用。
而且可能跟你的酶活也有关。
个人意见，权当参考吧。

底物应该是是进入胞内了。楼主制备半乳糖苷酶是为了生产低聚半乳糖吗？

之前我们用酵母菌制备半乳糖苷酶（胞内酶），也出现您提到的现象，但酶确实在胞内。

底物没问题吧，ONPG容易分解。冰箱一周可能问题不大，但是确实容易分解。比对一下胞内和胞外酶的活性，这个问题似乎与你的实验（目标）关系不太大吧。