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标题:[未解决]试过疏水柱，DEAE柱纯化几乎没有效果咋办？

  [未解决]本主题悬赏 可用分 10  
未完~待续[使用道具]
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发表于 2013-8-31 13:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

试过疏水柱，DEAE柱纯化几乎没有效果咋办？

转载
我的重组蛋白分子量110KDa，载体是pet28a,酶切位点是Nde1和Hind3，纯化挂不上镍柱，然后我在C端加了个his标签，还是没能挂柱，不知道是否因为分子量太大影响挂柱。现在不知道怎么做，我想纯化出来。我试过疏水柱，DEAE柱纯化几乎没有效果。希望大家给予我建议，谢谢。
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80年代的人[使用道具]
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发表于 2013-8-31 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先我没弄清楚你的纯化策略：
我的重组蛋白分子量110KDa，载体是pet28a,酶切位点是Nde1和Hind3，纯化挂不上镍柱，然后我在C端加了个his标签，（难道你之前没有加tag吗？）
然后：我之前也遇到过同样的问题，但是我最开始是在C端加了tag，然后蛋白基本上在低浓度清洗的时候全部被洗脱了。后来查了蛋白的结构，因为i蛋白会在C端互相作用而形成二聚体，所以，很可能是tag在表达后被剪切了。后来在N端加了tag，纯化出大量的蛋白。希望此经验对楼主有用。
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发表于 2013-8-31 13:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也遇到过同样的问题，但是我的不是完全不挂柱子，而是低浓度就能洗脱下来，不挂柱子情况主要有，镍失去活性。二，蛋白结构的构像发生改变，组氨酸标签被折叠到里面
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发表于 2013-8-31 13:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你可以用NTA-0，里面不加咪唑的先平衡，然后再用能将目的蛋白杂峰洗脱下来最多的相应咪唑浓度实验一下，我做蛋白纯化一般是用20 40 60 80 100 200 300  500mM 的分别洗脱，找到洗脱最适浓度
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疲惫黑眼圈[使用道具]
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发表于 2013-8-31 13:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不挂柱可能是镍柱使用时间过长，考虑重生
还有可能是表达的蛋白空间位阻挡住HIS
不知道楼主是用什么方法纯化的 如果用AKATA可以梯度洗脱看看峰值再判断
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艾玛@加油[使用道具]
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发表于 2013-8-31 13:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主可以先试试不加咪唑挂柱子试试 可能是his标签被包埋了，可以考虑在变性条件下挂柱试试。
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=心晴=[使用道具]
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发表于 2013-8-31 13:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Tag被剪切了，你再变性也挂不上！。。。。。换载体吧
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