环境分析

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最近开始做土壤pcr-dgge试验了，我是用MP公司的试剂盒提取土壤DNA的，但是我提取的dna是黄色接近棕色的，这是为什么？腐殖酸太多吗？然后做16Spcr时，我用四个同时提取的不同模版，分别稀释0,2,5,10倍，结果只有稀释5倍扩增一个出来，10倍扩增2个出来，这是为什么？我接下来的16Spcr要扩增更多倍数来做吗？在接下来的V3区pcr该怎么做比较好？
去年我在其他学校学习的时候做的dgge胶染色后条带非常少，我是用8%的胶，梯度是30-50%，后面渐渐改成30-40%,条带还是那几条，这是为什么？我该怎么改进？用的土样是森林里的表层土，这种土不是应该微生物很丰富吗？还有dgge胶我后面是还要用quantity one软件分析，请问是用扫描仪扫描比较好，还是用凝胶成像仪拍照比较好？相机能拍吗，拍的照片能用于软件分析吗，会不会有误差？
不好意思，问题有点多，我是刚开始做pcr-dgge的菜鸟，都说这个技术不好做，我是我们院第一个做的，也没有人带，一切都要自己摸索，很茫然啊，请各位大侠相助！！！

应该是你提取的DNA腐植酸含量太高了，影响了PCR的效率。一般来说，模板里面杂质太多影响PCR的话，可以通过降低模板量来减少杂质，从而提高PCR的效果。我觉得你还是纯化一下比较好，颜色看着发黄肯定不好用的。
DGGE，我用的是6.5%的浓度，40——60%，不过，我觉得你条带还是PCR的问题，PCR不好扩增不出来啊。你说用Quantity One分析，我也试过，我是用成像仪拍照的，扫描仪没用过不清楚，相机拍的也就看看而已，分析的话应该是不成的。

前面的问题PCR问题，我来回答你，后面的DGGE我不做，所以没办法了。
MP试剂盒提出来的效果还是不错的，里面的腐殖酸含量确实很高，你放在冰箱里冻一下，隔天的效果就差了很多，所以需要稀释一下，我也是稀释5倍然后拿来做实验的，我曾经试过拿胶回收试剂盒把基因组DNA回收一下，效果还不错，如果你一直扩增不出来，你可以试试！

如果要用Quantity One做分析，最好还是用DGGE检测系统专用的成像仪拍叫，那是最理想的了，如果没有的话，可以用普通凝胶成像仪拍，保存成tiff格式的图片，这样Quantity One就可以打开图片进行条带识别和分析了。不过最重要的还是前面PCR样品的准备。祝你好运！

我们实验室一直用的是MOBIO的PowerSoil试剂盒，提出来效果不错，可以直接用于下游PCR实验~

可以先测一下DNA浓度，再稀释到10到20纳克左右作为模板再PCR，后面的DGGE可保存为TIF格式，再用quantity one分析，我觉得PCR扩得好才是关键

纯化可以用试剂盒也可以自己手工。我做的是农田里面的土壤，有机质含量很高的，用的OMEGA的试剂盒，也没有像你说的颜色发黄，OD260/230很低，也不影响PCR。我不清楚你的土壤样品是什么，不过你是不是用试剂盒的时候操作有问题啊？在我的印象里，MO的盒子好于OMEGA，我用手提法提取DNA的颜色才是黄色，PCR的时候有些引物还是可以扩增出来的啊。
你说的PCR问题，扩增有没有问题和条带亮度没有太大关系，条带亮只能说DNA含量高而已。

这位仁兄 我也刚开始做DGGE  一直跑不出来带啊~~就有一次跑出二十多条 但是达不到切胶回收的标准 半个多月了 快伤死了  提DNA没用试剂盒 CTAB提的  感觉不是样品的问题 求交流

那个仪器的电流有问题 亮度这个东西说白了就是插入双链的染料多，小片段数量多可以很亮，大片段数量少也可以插入很多染料显得亮，所以不能简单的以亮度来判断。

比如通过Mark比对大小对不对啊，已知序列的PCR还可以测序测定，还有看看泳道是否有拖尾弥散的现象等等。