小中大用超声波,微波等处理,效果是否会好些呢?
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酶解法:
a. 用TE缓冲溶液洗涤湿菌体两次,即加入1000 μL TE缓冲溶液混匀后,12,000 r/min离心2 min,弃上清,重复l次后,悬浮于200 μL TE缓冲溶液中;
b. 加入100 μL溶菌酶(10 mg/mL TE溶液)至管中,36℃放置30 min,随后室温静置30 min;
c. 加入20 μL蛋白酶K(5 mg/mL水溶液),55℃放置2 h,随后室温30 min;
d. 加入150 μL10% SDS,65℃放置30 min,随后室温30 min;
e. 加入等体积的饱和酚/氯仿溶液抽提,12,000 r/min离心5 min,收集上清,重复一次;
f. 加入等体积的氯仿溶液抽提,12,000 r/min离心5 min,收集上清;
g. 加入0.1倍 3M NaAc混匀,随后加入2倍无水乙醇,置﹣20℃ 30 min,12,000 r/min离心5 min留沉淀;
h. 75%乙醇洗涤2~3次,干燥后,加入20 μLTE溶解DNA,4℃保存。
发现菌体细胞壁无法裂解,溶菌酶新买的,用量我看文献一般在20-30 μL,看不到DNA,沉淀过夜,离心有微量白色沉淀,是蛋白还是DNA呢?琼脂糖电泳检测不出来。实验重复了几次,还是一样的结果。
后面改用SDS高盐法。SDS加了20% 500μL ,0.5 mol/L EDTA l裂解菌壁和沉淀蛋白;5mol/L NaCl 100 μL ,2%CTAB/NaCl 80 μL 抽提,结果在用乙醇沉淀DNA时,发现分层,还有白色沉淀,试验了一下,在20%SDS中加NaAc就会出现白色沉淀加分层,怎样才能去除过量的SDS呢,SDS能与DNA形成复合物,溶于高盐,低盐析出,分层了,DNA 会在哪一层.SDS我确实使用的比较多,目的是裂解菌壁。
有关文献报道用超声波,微波等处理,效果是否会好些呢?