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标题:[未解决]用超声波,微波等处理,效果是否会好些呢?

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用超声波,微波等处理,效果是否会好些呢?

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酶解法:
a. 用TE缓冲溶液洗涤湿菌体两次,即加入1000 μL TE缓冲溶液混匀后,12,000   r/min离心2 min,弃上清,重复l次后,悬浮于200 μL TE缓冲溶液中;
b. 加入100  μL溶菌酶(10 mg/mL TE溶液)至管中,36℃放置30 min,随后室温静置30 min;
c. 加入20  μL蛋白酶K(5 mg/mL水溶液),55℃放置2 h,随后室温30 min;
d. 加入150 μL10% SDS,65℃放置30 min,随后室温30 min;
e. 加入等体积的饱和酚/氯仿溶液抽提,12,000 r/min离心5 min,收集上清,重复一次;
f. 加入等体积的氯仿溶液抽提,12,000 r/min离心5 min,收集上清;
g. 加入0.1倍 3M NaAc混匀,随后加入2倍无水乙醇,置﹣20℃ 30 min,12,000 r/min离心5 min留沉淀;
h. 75%乙醇洗涤2~3次,干燥后,加入20 μLTE溶解DNA,4℃保存。
发现菌体细胞壁无法裂解,溶菌酶新买的,用量我看文献一般在20-30 μL,看不到DNA,沉淀过夜,离心有微量白色沉淀,是蛋白还是DNA呢?琼脂糖电泳检测不出来。实验重复了几次,还是一样的结果。

后面改用SDS高盐法。SDS加了20% 500μL ,0.5 mol/L EDTA  l裂解菌壁和沉淀蛋白;5mol/L NaCl 100 μL ,2%CTAB/NaCl 80 μL 抽提,结果在用乙醇沉淀DNA时,发现分层,还有白色沉淀,试验了一下,在20%SDS中加NaAc就会出现白色沉淀加分层,怎样才能去除过量的SDS呢,SDS能与DNA形成复合物,溶于高盐,低盐析出,分层了,DNA 会在哪一层.SDS我确实使用的比较多,目的是裂解菌壁。

有关文献报道用超声波,微波等处理,效果是否会好些呢?
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疲惫黑眼圈[使用道具]
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酶解法就行了。
如果是少量提取,你溶菌酶37℃放置1小时;大量提取最好37℃摇床上震荡3小时左右,不要怕弄断DNA。
你溶菌酶处理后要看见菌体溶解再往下做。
PK不用2h的,30min也行。
别的操作大体都行,推荐你看一下《一种简单有效的适于PCR操作的放线菌DNA提取方法》这篇文献,可以自己适当修改。
还有少量提取的时侯,除非菌体酶解很彻底,一般看不见DNA,但是溶解在35ul TE中PCR加0.8ul左右当模板没问题。
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艾玛@加油[使用道具]
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我们用的是试剂盒,专门适用格兰氏阳性菌的,比一般的试剂盒效果好出不少,但是分成各步不知道是哪一步改变较大,你查阅下相关文献
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=心晴=[使用道具]
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你PCR试一下就知道了。 庄盟试剂的革兰氏阳性的基因组试剂盒,具体名字和型号不记得了。纺线菌基因组GC含量较高,PCR时加一定量的DMSO有奇效
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不化妆的lay[使用道具]
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有微量测定仪么?测一下OD值和DNA含量。
你后续步骤要做什么了?你只需要PCR一次就知道按这个方法能提出来,以后就这样操作就行了吧
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哦买噶[使用道具]
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溶菌酶处理时间太短了,过夜没问题,可以用细胞破碎仪打一下效果更好,菌体稍微多点
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集贤阁[使用道具]
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7
 
菌体不用裂解到透明,SDS终浓度2%,不用采取过滤、烘干,你的除非是稀有放线菌,不然不会那么难提,菌体最好新鲜些
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哈达[使用道具]
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我怀疑楼主做的极端放线菌。我以前做过,发现很多放线菌,尤其是极端放线菌是抗溶菌酶的,因此用溶菌酶是不行的。建议用液氮研磨破碎,保证能提出来
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