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标题:[未解决]跑SDS-PAGE确不能判断目的蛋白条带，怎么办呢。

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发表于 2013-8-31 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

跑SDS-PAGE确不能判断目的蛋白条带，怎么办呢。

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最近在做蛋白质的分离纯化，硫酸铵沉淀后过DEAE阴离子交换柱，测酶活可知目的蛋白的出峰电导，但是跑SDS-PAGE确不能判断目的蛋白条带，怎么办呢。
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集贤阁[使用道具]
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发表于 2013-8-31 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1. 建议接前峰， 峰尖，和后峰，各200uL，加电泳Buffer处理后，做SDS-PAGE。

2.你的情况也可能是有酶活，但是蛋白浓度太低，SDS-PAGE检测不到。
SDS-PAGE 我觉得20~50 mg/L的蛋白都能检测到啊。
这种情况你需要浓缩穿出液了。
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哈达[使用道具]
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发表于 2013-8-31 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得你不应该是接 电导出峰，而是蛋白吸收出峰才对，就是接280nm的峰啊。
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哈达[使用道具]
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发表于 2013-8-31 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对，收集整个峰，会极大地稀释蛋白浓度的。
因为峰尖前后蛋白浓度会较低。
所以，应该收集峰尖走电泳嘛

浓缩，主要是用三氯乙酸沉淀（最终工作浓度是5%左右），离心，然后洗涤，加适量电泳buffer煮。。。5mL都可以浓缩成200uL
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发表于 2013-8-31 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
依据蛋白质条带和酶活力的强弱变化推断 你们直接就过DEAE柱吗 我们都是先过一个G-25柱 脱盐   过DEAE接样时 我们都连接一个HD-9707紫外检测仪 在线监测 然后子根据实际情况 根据示数接样 那样接的样 纯度 浓度 都能高点
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