小中大DGGE经验总结 1.跑第一张图前，确保所有的上样样品V3亮度达到要求，否则容易浪费试剂和时间。（最 近是用的生工的2000Marker，没有加强带，所以比对不出来亮度和含量，建议以后用宝生物的DL2000Marker，因其有750bp的加强带，可估测DNA的含量！呵呵，当时图便宜，就改用生工的Marker了…） 2.跑胶点样顺序最好按顺序，以便于之后比较。 3.纯化DGGE切回的条带，一次跑2板，即平衡板也点样。早上扩V3（V3体系为25微 升即可，没必要用50微升的体系，随机取几个样进行凝胶电泳验证，我一般只验证两三个样和阴性对照，以确保没有污染。）。大约11点扩好之后，加10微升溴酚蓝，直接上样，大约12点就可以跑上电泳。跑5个小时之后，先拆下一板胶，另一板连同架子一起放在缓冲液里（一定放在缓冲液里，如果放在外面，条带容易弥散，不利切胶），胶染色20min即可，在切第一板胶的同时将第二板胶染色，切完第一板胶后就可继续切第二板胶，然后洗胶2遍。如此，一次可跑32个样，不仅缩短了工作时间，而且还节省了试剂。从实验结果看，前板胶和后板胶（平衡板）电泳后的结果基本上没有区别。个人经验此法非常可取，事半功倍。 4.DGGE切胶之后一般纯化2次，建议第一次纯化时V3条带不要太亮（可在扩V3的时 候减少模板量）。假设V3条带很亮，目的条带也很亮，则目的条带周围的杂带不利于切胶纯化；若V3条带不很亮，目的条带也弱，则目的条带周围的杂带也弱，切回的胶中杂带也少，利于纯化，第二次纯化扩V3时可增加模板量，以便突出目的条带。5.夹板：1.玻璃板干净，表面无水无凝胶块。 6.漏胶现象：1.两块玻璃板夹不紧。2.玻璃板-夹条-玻璃板低端不平整，即夹条靠上。 3.玻璃板与夹子之间有空隙。 7.灌胶：1.梯度高低正确。2.注射器内无气泡，注射器夹在推进器之前将气泡弹出。3.推进 器位置正确。4.灌胶连续，不要间断，速度适当勿太快太慢。 8.点样：1.上样量一致。2.点样针抵住玻璃板注射，以免针在点样孔中摆动搅乱点样液。 3.点样针在点样孔底部，推进时样品是上涌而不是下落。4.点样量勿多，以免样品溢出造成交叉污染。 9.跑胶：1.架子放入，左黑右红原则。2.搅拌棒不要太靠近玻璃板。3.打开电源后，稍等一 会等仪器稳定后再操作。4.设定温度，再开heater，再开pump，等抽水一定时间后（液面接近黑色顶部）开电压，按run。5.一定要等到60度再开始电泳。E1对策:1.加减缓冲液。2.确保接触良好（尤其是盖子）。3.确保架子上的液面盖过内槽。E9对策：电泳液混匀。E10对策：电压正确。 10.染胶：1.20-30min即可，不可太短。2.事先将托盘洗净，以免挂胶，导致摇胶不匀胶断 裂。 11.切胶：1.利用画图工具，从上而下，依次切回。2.每切一条带，需用酒精棉擦净切胶刀。 3.切回之后立即洗胶，或者放于-20隔夜洗。
