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标题:【讨论帖】Western 及抗体

mimili_901[使用道具]
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发表于 2013-9-5 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在要做核蛋白的WESTERN BLOT，但是我按照梁国栋主编的《最新分子生物学实验技术》的细胞核提取物的快速制备法来提核蛋白，但是提出后，我用BCA试剂盒测蛋白的浓度，发现蛋白浓度太低，只有1-2微克/微升，而我担心这样的浓度如果做WESTERN BLOT的话，每个加样孔的蛋白上样量是不是太低啦（每孔上样15-20微升，那上样量顶多是30微克左右），这样的话做WESTERN BLOT的话，是否很难出结果呢？
您提过核蛋白吗，您的蛋白浓度一般是多少？
您用过DAB来显色吗？（核蛋白的WESTERN BLOT）
另外，问一下，膜到底是用去离子水浸泡，还是用转膜液？因为分子可隆上写的是用去离子水浸泡5分钟以上啊！
请不吝赐教，谢谢啦！
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-9-5 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你可以尝试先用M15菌体总蛋白吸附病人血清后，再western blot，可以去除非特异条带。
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发表于 2013-9-5 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你用的是tank system吧，建议低电压，长时间，
如 28V 14－16hrs
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2013-9-5 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做HSP WESTEN定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能，请指点。
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jkobn[使用道具]
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发表于 2013-9-5 18:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也准备做WESTERN BLOT，想请教以下问题：
1 哪家公司的转印膜较好，帮忙推荐一下。
2 膜要如何处理？
3如果是6×8转印膜，要加多少一抗。
4 上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。
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lixi559[使用道具]
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发表于 2013-9-5 18:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问：在不知道抗体的分子量和PI的情况下，怎样来做电泳？
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发表于 2013-9-5 18:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1你可以将样品浓缩，方法你可以找到
2我做过DAB显色法，还挺灵敏的，你想问什么?
3膜你可以用甲醇泡，(PVDF)
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发表于 2013-9-5 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这多半是抗体的问题，你要看你抗体的说明，是否能做WB和IHC，
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发表于 2013-9-5 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你用的是tank system吧，建议低电压，长时间，
如 28V 14－16hrs

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为什么？

以上电压情况下，电流是几多？我们的机子可能只有10ma.
这可以吗？

转膜时恒压好些还是恒流好些？
有时候滤纸片和膜的大小及厚度不同电阻可能不同，相同电压下，电流会有不同！

望指点一二！

谢谢！
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发表于 2013-9-5 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不好意思，你那里是否有较好一点的灰度扫描软件。
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