【讨论帖】Western 及抗体 - 经验共享

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标题:【讨论帖】Western 及抗体

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发表于 2013-9-5 16:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

170kd, 如果用半干法建议2.0mA/cm2, 时间2hrs，（7％SDS-PAGE）

你的方法也可以，你一抗做了阳性对照吗？是否是你的一抗出了问题呢？

windy+++[使用道具]
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发表于 2013-9-5 16:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的胶是10％的,因为如果用半干的化,无法恒流,所以电流刚开始时一般是大于2.0mA/cm2,但后来会逐渐下降,就达不到2.0mA/cm2了,可能会有一些影响。但是用水浴重复性也不好。我的这个实验倒是没做阳性对照（不知你说的阳性对照是不是指已知含目的抗原的样品？），一抗是从博士德买的，可是我们实验室里别人也从那儿买的，结果还可以。所以我还是很困惑。

windy+++[使用道具]
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发表于 2013-9-5 17:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 windy+++ 于 2013-9-5 16:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我用的胶是10％的,因为如果用半干的化,无法恒流,所以电流刚开始时一般是大于2.0mA/cm2,但后来会逐渐下降,就达不到2.0mA/cm2了,可能会有一些影响。但是用水浴重复性也不好。我的这个实验倒是没做阳性对照（不知你说的阳性 ...

半干法肯定可以衡流，你用什么power supply?,

u234[使用道具]
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发表于 2013-9-5 17:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的是M15表达的一段47KD的蛋白，纯化后12%PAGE电泳肉眼几乎看不出杂带，做western显色后细菌对照出现色带，纯化过的目的带包括其上下都出现了色带，用病人恢复期血清做一抗。
请问是否是表达菌的问题，还是可能其他原因，谢谢！

NBA[使用道具]
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发表于 2013-9-5 17:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

"纯化过的目的带包括其上下都出现了色带"
你是说纯化的很好，但是Western有杂带，还是上下都有，对吗?

yes4[使用道具]
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发表于 2013-9-5 17:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好!
请问我显影液显影1分钟,和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?
我是在红光下操作的,显影液和定影液都是新鲜配制的,我曾经做了p53的western,可以做出来,现在我的条件(一抗,二抗及电泳和转膜)和以前完全一样,显影液也是一个公司的.
真搞不懂!

fei1226com[使用道具]
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发表于 2013-9-5 17:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的是BIORED全湿转膜的仪器，300v,400mA,75w.电泳过程中经常出现E9是什么回事？
另外想请教一下我测HIF-1,积层胶100v分离胶150v，转膜350mA1.5小时-2小时。电泳时电压多少最好？

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发表于 2013-9-5 17:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 yes4 于 2013-9-5 17:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你好!
请问我显影液显影1分钟,和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?
我是在红光下操作的,显影液和定影液都是新鲜配制的,我曾经做了p53的western,可以做出来,现在我的条件(一抗,二抗及电泳和转膜)和以前完全一样,显 ...

你看是否是胶片已经曝光了,
1.可能是红灯造成的,可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.
2.胶片本来就被曝光了
3.显影时间过长.
自己摸排一下,有问题再问

NBA[使用道具]
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发表于 2013-9-5 17:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 fei1226com 于 2013-9-5 17:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我用的是BIORED全湿转膜的仪器，300v,400mA,75w.电泳过程中经常出现E9是什么回事？
另外想请教一下我测HIF-1,积层胶100v分离胶150v，转膜350mA1.5小时-2小时。电泳时电压多少最好？ ...

你要测的是乏氧抑制因子吗？
它的制样过程要小心。
E9是出错的标志，你转移过程中有一项指标超过了仪器的负荷。
我们一般电泳是积层胶60-80v分离胶100v

mimili_901[使用道具]
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发表于 2013-9-5 17:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我去年做了一两千个western blot 什么事都遇到过了，技术超强，有问题只管问，但是我的时间有限，问问题最好能具体点，我才好回答。请尽量用帖子发，这样会有更多人受益！

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请帮我分析一下我的转膜效率低的原因：半干法：电压：15V，时间45分钟，目的蛋白：95KD，分离胶：百分之六。电泳条件：60V 30分钟，80V 3.5-4.0小时。下面是我的经丽春红染色后的结果：左边第一道为MARKER，好象也没有转上，其他的为样本。

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