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标题:【讨论帖】Western 及抗体

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发表于 2013-9-5 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我看不到图呀，另外从你的转移时间看，不够，我们一般做100KD左右的蛋白是2.0mA/cm2，1.5hrs, 8%的分离胶。
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mimili_901[使用道具]
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发表于 2013-9-5 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我看不到图呀，另外从你的转移时间看，不够，我们一般做100KD左右的蛋白是2.0mA/cm2，1.5hrs, 8%的分离胶。

我的图贴不上去，参照分子克隆上的5%的分离胶的分离范围是57-212KD，7.5%的分离胶的分离范围是36-94KD，10%分离胶的分离范围是16-68扩大，应该是5%到7.5%之间的胶才对呀！？
另外，你所说的2.0mA/cm2怎么讲，是根据胶的面积要求的电流吗？
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发表于 2013-9-5 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 mimili_901 于 2013-9-5 17:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我看不到图呀，另外从你的转移时间看，不够，我们一般做100KD左右的蛋白是2.0mA/cm2，1.5hrs, 8%的分离胶。

我的图贴不上去，参照分子克隆上的5%的分离胶的分离范围是57-212KD，7.5%的分离胶的分离范围是36-94KD，10%分离胶的分 ...

是的， 是按“胶”的面积要求的电流
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发表于 2013-9-5 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好：
我今下午研究了一下BIO-RAD的转膜仪。
我以前转膜的条件是：“恒压”15V，我观察了3分钟后，电流是95mA左右，我转膜45分钟，但结果转膜效率很低。
您建议我的按您所讲“恒流”而非“恒压”的原则及2mA/cm2，我的目的蛋白是100KD左右，我的“胶”的面积是25cm2，那么我的转膜电流是50mA啦，我观察了3分钟后，电压大概在7-8V左右，转膜1.5hrs。
您认为我的15V，95mA，45分钟的条件与您建议的50mA，7-8V，1.5hrs的条件，哪个转膜效率会更高一些呢？
望不吝赐教，谢谢！
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发表于 2013-9-5 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一般参照 膜>= 滤纸> 胶, 就行，

你转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的， 最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。

一般Buffer和滤纸选的对就不会短路

======================================

我们一般是按照 胶= 膜>滤纸 ,这样才不会短路啊！
按照你所说的 膜>= 滤纸> 胶,会发生短路啊！
能解释一下吗？
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发表于 2013-9-5 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
"纯化过的目的带包括其上下都出现了色带"

你是说纯化的很好，但是Western有杂带， 还是上下都有，对吗?

========================================

是的,而且对照菌也出现了条带,会是什么原因?谢谢
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发表于 2013-9-5 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好：
我做WESTERN的检测的时候，用DAB显色还能看出条带，但是换成ECL的时候什么样结果都没有。我用的NOVA公司的发光底物，胶片是普通的X片，定影液和显影液都是别人留下来的，不知道是什么原因，能赐教吗？
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发表于 2013-9-5 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得有3个原因，
1.一抗有问题，效价太低，且未纯化。
2.表达量太低
3.你提蛋白时是否出了问题
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NBA[使用道具]
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发表于 2013-9-5 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一般的说，Ecl比DAB更灵敏，但是DAB是HRP最敏感的底物，所以有几种可能：
1. ECL底物失活了，你可以检测一下
2. 敏感度正好不到ECl底物的范围。DAB能显色可不能催化ECL底物。
3.显影液没用了。
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mimili_901[使用道具]
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 小中大
上样缓冲液到底是1*SDS还是2*SDS？
所谓1*SDS是加等量样本前的浓度，还是加等量样本后的浓度？
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