蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】Western 及抗体

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 2552  6/256 |‹‹‹45678910111213›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】Western 及抗体

NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
51

发表于 2013-9-5 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你是说定量检测还是定性？
定量我还不会， 定性可以在暗室中将底物混合好，再加已知好的Hrp，（极微量便可），看是否有荧光。
顶部
xyw5[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75137
精华 1
积分 620
帖子 815
信誉分 102
可用分 4991
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
52

发表于 2013-9-5 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人拟作心肌组织CAMKII及P-CAMKII的western blot,拟按照分子克隆实验指南第二版上的对组织碎片的处理方法进行样本制备,即以悬浮缓冲液
0.1mol/L NaCI、 0.01mol/L Tris.CI（PH7.6）、 0.001mol/L EDTA（8.0）、1ug/ml aprotinin、100ug/ml PMSF分散组织，尽快加入等体积的2xSDS凝胶加样缓冲液，然后煮沸及离心。我的问题是该方法所用的蛋白酶抑制剂是否合适，另磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等。盼答，谢谢。
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
53

发表于 2013-9-5 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 xyw5 于 2013-9-5 17:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
本人拟作心肌组织CAMKII及P-CAMKII的western blot,拟按照分子克隆实验指南第二版上的对组织碎片的处理方法进行样本制备,即以悬浮缓冲液
0.1mol/L NaCI、 0.01mol/L Tris.CI（PH7.6）、 0.001mol/L EDTA（8.0）、1ug/ml aprot ...

Buffer 没有问题, 蛋白酶抑制剂也可以,
NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。我做的时候从未加过，都做出来了
顶部
mimili_901[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73543
精华 0
积分 564
帖子 723
信誉分 102
可用分 4458
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-24
状态 离线
54

发表于 2013-9-5 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一般参照 膜>= 滤纸> 胶, 就行，

你转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的， 最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。

一般Buffer和滤纸选的对就不会短路

===============================================

Buffer和滤纸选的对是什么意思啊？能具体解释一下吗？
Buffer指的是转膜液吗？是不是BIO-RAD的滤纸就不会短路！
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
55

发表于 2013-9-5 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 mimili_901 于 2013-9-5 17:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
一般参照 膜>= 滤纸> 胶, 就行，

你转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的， 最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。

一般Buffer和滤纸选的对就不会短路

===================================== ...

Buffer指的是转膜液吗？是的，你用的就可以。
是不是BIO-RAD的滤纸就不会短路！ “我这里说错了， 不是短路是烧膜，用Bio-Rad 就不会烧。
顶部
mimili_901[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73543
精华 0
积分 564
帖子 723
信誉分 102
可用分 4458
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-24
状态 离线
56

发表于 2013-9-5 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #55 NBA 的帖子

哎，可惜的是，我的Bio-Rad 膜已经用完啦，要不然就会省去很多麻烦，现在看来只能用普通滤纸代替看看效果怎样啦，ptglab,是不是普通滤纸按照你说的膜>=滤纸>胶就会烧膜呢？
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
57

发表于 2013-9-5 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 mimili_901 于 2013-9-5 17:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
哎，可惜的是，我的Bio-Rad 膜已经用完啦，要不然就会省去很多麻烦，现在看来只能用普通滤纸代替看看效果怎样啦，ptglab,是不是普通滤纸按照你说的膜>=滤纸>胶就会烧膜呢？ ...

不一定的， 你转移过程中多注意就可以了。
顶部
mimili_901[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73543
精华 0
积分 564
帖子 723
信誉分 102
可用分 4458
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-24
状态 离线
58

发表于 2013-9-5 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #57 NBA 的帖子

我的Western转膜已经成功了，但是Marker泳道未见蛋白条带（正常应该有6条）
，其余各泳道均有清晰的蛋白条带，经考马斯亮蓝染胶，结果相同。经5％的脱脂牛奶封闭1小时45分钟后，进行一抗孵育（1：200，建议起始浓度）过夜，二抗孵育5个半小时（1：2000），均在室温下，DAB显色，虽出现蛋白条带，但较弱，且出现非特异性条带。请ptglab帮忙分析一下：
1、Marker是否有问题？是MBI公司的，可分离14-116KD的蛋白，买了大概有一年的时间啦。
2、一抗（为多克隆抗体）、二抗的浓度及孵育的时间是否合适？
3、封闭的时间是否太短？
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
59

发表于 2013-9-5 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
恭喜呀！
1. marker 有可能被降解了， 也有可能是它标称的上样量太少， 不够， 我做过一个标称每次5ul可我上了20ul才行的。
2.建议，一抗4度过夜也很好， 建议1:100,室温2hrs就够了，
3. 2抗室温1小时，1:2000,
我喜欢4度封闭过夜（室温2hr就够了），1抗室温1hr，2抗室温1hr，

最好是一抗4度过夜（或室温2小时）1:200，2抗室温1小时1:2000， 换Ecl法.
顶部
duoduo[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74511
精华 0
积分 705
帖子 1009
信誉分 100
可用分 5926
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
60

发表于 2013-9-5 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教：
在作磷酸化蛋白时很多裂解液配方中又磷酸钠，作用是什么？
磷酸化蛋白的裂解过程有无特殊？
谢谢！
顶部
 2552  6/256 |‹‹‹45678910111213›››|