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标题:【讨论帖】Western 及抗体

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发表于 2013-9-5 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是NaF吧， 它是磷酸化酶的光谱抑制剂。
无特殊过程， 有时需要加NaF
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发表于 2013-9-5 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？
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发表于 2013-9-5 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我做线粒体膜UCP2蛋白的WESTERN BLOT，提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120ug，换了个santa cloz的一抗仍不行。现在怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂；你的意见呢？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？
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发表于 2013-9-5 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好象不是很好，请帮忙分析一下！谢谢！


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发表于 2013-9-5 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、请问您裂解细胞用什么配方，对于磷酸化的蛋白配方有无区别？
2、对于磷酸化的蛋白是否可用5%的脱脂奶粉封闭？Cell Signal的说明书上说多克
隆抗体建议用BSA，单克隆抗体用5%脱脂奶粉封闭，不知您有何体会？
3、难道一定要用封闭液稀释一抗吗？
4、我想知道您的实验步骤？一抗的稀释倍数，孵育时间，二抗的稀释倍数，孵
育 时间？封闭的时间？尤其对于磷酸化的抗体。
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发表于 2013-9-5 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
表达丰度低的蛋白,又不能用ECL KIt 来做,如何提高灵敏性?谢谢
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发表于 2013-9-5 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
做200kd蛋白的Western Blot时要注意，
1. 分离胶最好选择>7%的， 6%最好了。
2. 剥胶时要注意。
3. 转移时间相应延长。
4.要做分子量参照。（否则出现杂带不知道如何分析）。
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发表于 2013-9-5 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你说的2个可能是对的，
但建议检查Wb过程， 提高一抗浓度。再做一遍。
加PMSF一般就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
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发表于 2013-9-5 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这是正常的，大分子的蛋白转移的慢， 你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。
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发表于 2013-9-5 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、请问您裂解细胞用什么配方，对于磷酸化的蛋白配方有无区别？
无大的区别，最好加NaF。
2、对于磷酸化的蛋白是否可用5%的脱脂奶粉封闭？（建议用BSA）
Cell Signal的说明书上说多克隆抗体建议用BSA，单克隆抗体用5%脱脂奶粉封闭，不知您有何体会？（这么做没有任何意义）

3、难道一定要用封闭液稀释一抗吗？ 不定，实验步骤是可以根据实验的结果来调整的。
4、我想知道您的实验步骤？一抗的稀释倍数，孵育时间，二抗的稀释倍数，孵
育 时间？封闭的时间？尤其对于磷酸化的抗体。
不是我不告诉你，告诉你也没有用。你要根据自己的抗体和蛋白来定这些条件。
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