【求助】western blot湿转时，用恒压还是恒流，条件是多少？ - 经验共享

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标题:【求助】western blot湿转时，用恒压还是恒流，条件是多少？

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发表于 2013-10-10 15:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我转40-50da的蛋白，70v,120min.
20kda蛋白，200mA,120min,
bio-rad仪器，湿转，效果都很好的。

luoliqiong[使用道具]
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发表于 2013-10-10 15:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们用300MA 1小时效果不错以前也看到园子里有伙伴认为恒流比恒压好，我复制过来大家参考参考

建议恒流,理由如下:
1.转膜中热量产生很多,导致缓冲液甲醇的挥发消耗,缓冲液成分变化,如果恒压会导致电流不断改变,转膜过程不平稳.
2.调节到恒流后,电压会变化,但是缓冲液中带电粒子运动稳定,有利于转出高质量的膜.
3.一般小分子蛋白(<50KD)可以300mA 1.5小时,大分子蛋白300mA 2.5h ,效果不错.

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发表于 2013-10-10 15:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

100V 90min就够了

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发表于 2013-10-10 15:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

80ma，70min也够了

ffaa[使用道具]
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发表于 2013-10-10 15:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

恒流，300ma，一个小时足够了

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发表于 2013-10-10 15:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是用国产六一的转移槽，蛋白是66kd，100mA，45min就可以把目的蛋白转到膜上去了。用的是PVDF，0.22uM

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发表于 2013-10-10 15:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主提出的问题我觉得分析应该更全面一些。现在大部分人做WB实验应该都是用bio-rad装置吧，转膜时既可以采用恒压亦可以采用恒流，但不管你采用何种方法都是为了将目的蛋白尽可能多的转到膜上。每个实验者都是根据自己目的蛋白分子量大小，表达位置，表达量多少，是否容易降解来选择实验条件。比如说你要检测大分子量蛋白，蛋白表达又比较少，且易降解，那么最好是当天提蛋白、当天做实验，剩余的蛋白样品保存在-70°而不是贪图方便放在-20°冰箱，转膜时就适宜选择恒流（如楼上所说防止在恒压条件下，电流变化过大，产热多，目的蛋白降解，甲醇挥发凝胶不稳定），转移液最好是新鲜配制的（最多用2~3次，转以后最好保存在4°冰箱）。。。

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发表于 2013-10-10 15:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的是恒流，270mA，100min。没有失败过一次。

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请问，你的转膜缓冲液是这样的吗： 144g甘氨酸，30.3ｇTris碱，用双蒸水定容至1L，即为10×转膜缓冲液？？谢谢。因为我们实验室用的湿转， bio-rad 公司的仪器，加水到快满的样子。常规我们用120mA, 60min 转膜，基本上100kd以下的都没问题，电压一般是33V左右。而你用了270mA, 100min, 是不是时间太长了啊，小点分子的会转到对面滤纸吧？？或者是叫缓冲液位置不同呢？

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发表于 2013-10-10 15:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

pvdf膜是需要用甲醇活化的，膜的正面反面放在甲醇中各15秒，然后放在水中2分钟，此时膜会在水上打转，没关系，你可以用镊子将其按压至水中。

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发表于 2013-10-10 16:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

活化后的膜更容易将蛋白转移至膜上。

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