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标题:【求助】有关Triton X-114提取膜蛋白的问题

mogu[使用道具]
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【求助】有关Triton X-114提取膜蛋白的问题


各位同仁:
小弟我现在想用Triton X-114提取膜蛋白,Triton X114能与水在4度混溶,而在37度能形成水相和去污剂相。但我在做试验时将Triton X114水溶液37度水浴5min后,Triton X114溶液并没有变混浊,离心后也不会分层。这究竟是什么原因,敬请各位赐教!
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qumm1985[使用道具]
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一般使用triton114含量是1-2%,除此之外还要在溶液中加入tri和nacl作为缓冲体系,你可先用配好的试剂做一个空白试验,应该是可以的

先用40mmtri破碎细胞,然后再用triton114处理
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mogu[使用道具]
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我是在将细胞重悬在10mMTris,150mMNaCl,pH7.4的TBS中,然后加入终浓度1%的Triton X-114 。在4度混匀、离心取上清,移到37度没有预计的云雾状出现。再请问市售的Triton X-114 是液体的吗,国外的材料上好像说是固体的。
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mogu[使用道具]
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是液体的.我们用的就是一个大瓶子,纯的非常粘稠
你是室温离心吗?
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mogu[使用道具]
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是啊。上清移到37度没有一点cloudy的感觉,然后放在室温(至少20度)5000rpm离心10min,没有分层。空白实验我也做了,就是把1ml的Triton X-114 溶解在100ml的10mMTris,150mMNaCl,pH7.4的TBS中,混匀后移到37度,没有...
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Triton-114是很粘稠的,国内华美、生工都有分装。
它的溶解原理是 在低温(4度)的时候溶解度高,根据有机物相似相溶的原理这时膜蛋白就会和Triton-114相溶;在37度反而溶解度低,从而将大部分Triton-114连同膜蛋白一起析出分在下层有机相。
根据你的描述,没有分层可能有三个原因
1.可能你用的管太大,1.5mLEp管和50mL离心管的分离效果差很多
2.离心的时候要用水平转头,2000rpm 离心5-10min就行,离心完毕,小心取出就可以看到分层。
3.可能你Triton-114的配制方法不对,我是将Triton-114加入TBS(10mMTris,150mM NaCl,pH7.4)中形成终浓度1%的Triton-114,保存在4度,用时直接重悬细胞,冰浴作用30分钟后放入37度作用5-10分钟(根据管子大小),水平转头离心。

一些后续步骤:将上述沉淀(Triton-114与膜蛋白的混合物)加入9倍体积冰冻丙酮,冰浴40分钟,10000rpm离心20-30分钟,这时就可以将上层的丙酮和Triton-114一起去除,从而得到膜蛋白。
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另外,是否可以用肉眼看到37度形成的云雾状?如果将含有1%Triton-114的TBS(10mMTris,150mM NaCl,pH7.4)从4度移到37度5min是否也能分层?
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mogu[使用道具]
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这也主要取决于你用的管大小,小管可以看到云雾状,大管可以看到明显的分层界限,从4度移到37度理论上来说应该也能分层。
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qumm1985[使用道具]
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我用的也是1.5ml的离心管,可就是没有云雾。我的试剂是Amresco分装的,应该不会有问题。另外,为什么用水平转子,用角转子不行吗。谢谢
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yychen[使用道具]
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水平转头在高速旋转的时候容易使有机相和水相保持分层状态,而角转子是不可能保持两相分离的状态,自然就达不到分离膜蛋白的目的呀,两种不同转子离心原理不同啦。建议你按我上述的方法操作一遍。
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