【讨论帖】成功过的战友讨论下，你曾经ＷＥＳＴＥＲＮ... - 经验共享

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标题:【讨论帖】成功过的战友讨论下，你曾经ＷＥＳＴＥＲＮ...

c86v[使用道具]
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发表于 2013-10-21 16:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问楼上的:
"水煮三遍":是在染色液里煮胶吗?每次多长时间,间隔呢?

谢谢!!!

JK.jon[使用道具]
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发表于 2013-10-21 16:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家可以多讨论讨论磷酸化蛋白的WB方法

==========================================================================================================

我贴一个。
做过CREB-p水平检测，与测CREB最大不同之处在于保持CREB的磷酸化状态。我用的细胞裂解液中都含有氟化钠（NaF)和焦磷酸钠(NaPPi2) 两种成分，用来稳定CREB-p。因为检测creb-p的单克隆抗体很可能就是识别CREB与p结合部位的结构的，如果CREB-P在处理过程中降解，最后必然检不出来。
我看过的几个报阴性结果的文献中，其样品处理过程多数没有考虑保护磷酸基，这可能是失败的原因之一吧。
附上相关文献一篇：ZHao LX,Brinton RD.J Neurosci,2003,23(10):4228-4239.

qumm1985[使用道具]
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发表于 2013-10-21 16:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也一直在做ＷＢ，体会是一抗最关键！
其实有些蛋白特别是重组蛋白不用纯化一样可以直接上样，用量不宜太多，对照电泳带能看见就行，这样还能避免本底高的问题．如果一抗用单抗，则封闭不宜过长，一抗如果效价不高，可以适当延长反应时间，例如４度过夜．至于二抗和显影都比较常规，只是注意每步要好好洗膜，把非特异降到最低．另外膜也注意步要损伤，否则会影响显影．

windy+++[使用道具]
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发表于 2013-10-21 16:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的蛋白上有biotin，所以我只需要用到可以检测用的avidin就可以了，不用一抗，二抗。问几个很菜的问题：
1. 我想知道使用streptavidin-horseradish peroxidase做chemiluminescence检测的设备是什么？我们实验室只有一个扫描胶用的普通扫描仪，是不是不能用来做chemiluminescence检测？如果不行，有没有什么便宜的解决办法？
2. 请大虾们给推荐一个protocol

junjie05[使用道具]
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发表于 2013-10-21 16:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是个做western的新手，已经做了几次，均无结果。我觉得这些过程中最关键的就是蛋白的提取，一定要先有东西然后才能检测它。象我做膜蛋白，用的是提取的细胞总蛋白，做了几次western都没结果，现在也不知道到底我的蛋白有没有提取出来，还是别的方面有问题。真的很郁闷。所以，我觉得必须要保证你的蛋白提取是有效的，否则后面做的一切都是白费。

nut6694[使用道具]
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发表于 2013-10-21 16:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 junjie05 于 2013-10-21 16:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我是个做western的新手，已经做了几次，均无结果。我觉得这些过程中最关键的就是蛋白的提取，一定要先有东西然后才能检测它。象我做膜蛋白，用的是提取的细胞总蛋白，做了几次western都没结果，现在也不知道到底我的蛋白有没有 ...

蛋白制备确实非常关键，建议你在样品处理过程中可以试着不煮沸变性，加了LOADING BUFFER直接做一下看看。或者专门有提膜蛋白的KIT，针对膜蛋白水溶性不强的特点可以比较有效得提取较高丰度的样品。

INK[使用道具]
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发表于 2013-10-21 16:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我来说一下吧，平时做的挺多的，还是有点心得的。。。
第一，提取蛋白的问题：我不知道你们用的是甚么方法来提取蛋白的，基本上提取组织蛋白和细胞蛋白的方法都很成熟，所以我觉得这不是主要问题，关键无非就是浓度低点罢了，但是western的分辨率很高，不会影响到作不出来的。为了防治这方面的问题，可以设置阳性control。
第二，跑胶的问题的可能性就更小了，反正从我平时做的情况来看，这个几率是零，因为整个过程都在肉眼监视下操作，即使发生问题也很容易及时发现。倒是值得一提的是下胶的时候一定要小心，不然把胶弄坏了才叫心疼，整个重新来过，哭。。。。。
第三，转膜是个关键！！！首先转膜时间和电流需要根据你目的蛋白大小以及转膜方法，还有膜的材料等等因素相关联，具体需要慢慢摸索，也可以向你实验室做的好的师兄师姐请教，我就不赘述了。需要提醒一句的是：做小蛋白的时候一定要注意！！！因为它很容易降解，所以下胶和转膜之间的时间越短越好！切记!!
第四，抗体问题当然也是很关键，但是无论是商品化抗体还是自己打得抗体也好，再做之前都会经过检测的，所以出现问题的可能性也不大，除非你马虎大意地加错了，如加错二抗（我就犯过这个问题，把鼠的加成了兔的）！切忌！也可以通过对照来排除。。。
第五，显影出现的问题也不太常见，可以问问用过这批显影液的同实验室的人来确认。
其余可能出现的问题也很多，但是都是低概率事件，归根结底都是粗心大意造成的，因此状态不好的时候建议不要做试验，尤其是western这种时程很长的试验，一步有错，前功尽弃。。。。

稍微总结一下，我的观点就是转膜那一步最重要，一定要小心。。。。
希望有所帮助，呵呵

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2013-10-21 16:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

内参做出来，而目的蛋白大部分做出而有个别的做不出来不妨考虑一下几个因素：
1 仔细再阅读一下抗体说明书，单抗还是多抗，如果单抗是来源小鼠的还是兔的（CST公司有很多兔的单抗），如果是兔的单抗，二抗选择时就要用抗兔的多抗。
2 看看分子目标分子量的大小，确定胶的浓度，本人在做凋亡方面深有感触就是做Caspase的小片段，用15%、12%的胶就能做出，而10%的就做不出来。

kulee[使用道具]
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发表于 2013-10-21 16:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教高手：
分子量120kd的表达蛋白，8％分离胶，5％浓缩胶，电泳100v，2.5h；转膜恒流125mA，2h，此条件是否可以；另外，表达量较低，有什么好方法提高灵敏度呢，先谢谢啦

nut6694[使用道具]
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发表于 2013-10-21 16:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 kulee 于 2013-10-21 16:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教高手：
分子量120kd的表达蛋白，8％分离胶，5％浓缩胶，电泳100v，2.5h；转膜恒流125mA，2h，此条件是否可以；另外，表达量较低，有什么好方法提高灵敏度呢，先谢谢啦 ...

蛋白电泳时浓缩胶和分离胶的电压不一样，浓缩胶可以用８０－１００Ｖ，跑进分离胶后用１６０－２００Ｖ跑．
转膜你是用湿转还是半干转？根据我的经验，半干转条件，恒流１－２mA/cm2，转２－２．5小时．如果湿转，用恒压１００Ｖ转２．５小时．你试试，再根据转膜效果调整一下．
如果表达量低，可以通过浓缩样品蛋白，加大上样量等调节，也可以用比较灵敏的显影底物．

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