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标题:【讨论帖】成功过的战友讨论下，你曾经ＷＥＳＴＥＲＮ...

am10[使用道具]
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发表于 2013-10-17 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会
1、跑胶 电泳Buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个3－4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度；Buffer一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白；
2、转膜 我用的是湿转，Buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。
就这些了，请各位指正
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发表于 2013-10-17 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会
1、跑胶 电泳Buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个3－4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度；Buffer一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白；
2、转膜 我用的是湿转，Buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。
就这些了，请各位指正

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我的感觉是电泳跑胶时buffer的利用，如果蛋白跑出胶外，那下次一定就要更换，如果没有的话还能用一两次．
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zranqi_1[使用道具]
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发表于 2013-10-17 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是第一次作，作了3次，目前还没有成功。我发现跑胶的时候，有时候Marker会歪歪扭扭，转完膜（90V,4hr)后还有胶孔附近有残留，是不是没有转完全？另外，DAB染色和ECL那个好一点？如何操作？
盼各位大侠给个意见。
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nut6694[使用道具]
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发表于 2013-10-17 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先确定你的胶的浓度和离子强度没问题，如果胶不均匀Marker容易跑歪。转膜后看和你的蛋白分子量近似的预染Marker有没有转过去，如果marker没问题，那基本可以认为你的蛋白转过去了。显色的话应该ECL好些吧，灵敏度更高呢，HRP标记的二抗孵育完后用TBST充分清洗，然后加ECL试剂，包好后压片，一般如果你能够看到荧光的话，压片5min以内就可以看一下，如果看不见的话，直接压半小时吧。暗室仲压片，压片完后显影、定影、水洗，就可以了。
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xue258[使用道具]
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发表于 2013-10-17 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做了几个月western了，总结下本人在western中遇见的一些问题：

听过一个讲座，说是在抗体中加叠氮钠，可以在4度保存，避免抗体的反复冻融。结果我就犯错误了，二抗也加叠氮钠了，导致发光显不出条带，找原因找了一周，才知道叠氮钠能抑制HRP的活性。
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发表于 2013-10-17 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我所纯化的蛋白为未知蛋白，目前仅知其具有甘露糖结合的活性和分子量，想用WB的方法鉴定纯化出的蛋白是否具有结合甘露糖的能力。在实验的过程中一直得不到理想的结果，有两个问题请各位高手指教：
1、不知在SDS-PAGE和WB的条件下，蛋白的糖结合活性是否可得以保存
2、因为蛋白是未知的，所以没有抗体可用，我们用一种带有甘露糖基的BSA来代替抗体，并用10nm胶体金与之耦联作为显色之用。10nm胶体金之前一直用于电镜观察，不知可否用于WB的显色。请各位各个意见。
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发表于 2013-10-17 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我作WB，
第一次：SDS-PAGE电泳都没跑出来，怀疑是蛋白降解了，但是后来同样的样品和别人一起又跑一次，就跑出来了，发现是配胶的问题。分离胶要用12％的。
第二次：样品制备OK，浓度也测好了，电泳也跑得不错，PVDF膜不小心被手指划了一下，结果最后显影时候，显出来一个划痕。
第三次：我的B-actin做出来了，但是我的目的条带怎么也不出来，同样的条件，同样的过程，试剂也一样，我师姐的就做出来了，可见不是试剂的问题，显影同样用的DAB，这次考虑是抗体的问题了。
第四次：找公司换了抗体，果然ok了！
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eric930[使用道具]
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发表于 2013-10-17 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本底过高：
（1）封闭不好。
（2） 一抗、二抗作用强度过高。
（3） 洗涤不充分。
对策包括：
a. 延长封闭时间；
b. 可调节一抗，二抗的稀释度，找到一个最佳浓度，使之能得到有效强度的信号，而非特异性的染色较低。
c. 充分洗涤，将未结合上的非特异性的抗体洗掉，可在缓冲液中加0.02-0.2%Tween20。
假阳性： 多数由抗体和有部分同源性的抗原间的交叉反应引起。主要解决办法是在保证阳性结果可见的前提下，尽可能高地提高抗体稀释度，使假阳性消失
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mamamiya[使用道具]
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 小中大

我进实验室最先接触的就是WESTERN，我觉得首先要提出高质量的蛋白，然后一鼓作气往下做，不要放太久，即使－80度超过三个月结果也不太理想。新鲜的样品跑出来的条带很靓的。
实验室的温度对制胶很重要，气温过低会使凝胶不均匀，一、二抗也孵不上去，夏天的时候，不到8个小时就可以做完一个WESTERN，现在就不行了。
封闭液要保证有效。
一、二抗比例要适当，不然即使高浓度也没用。
转膜是个技术活，要耐心，但不是磨蹭。
化学发光试剂要好。
显影时间的控制和调整。
另外注意一些细小问题，比如缓冲液不要加错，上样要尽快，电泳时电压不要太高，洗膜要充分等，有时候往往会犯一些及其可笑的错误。
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阿k[使用道具]
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 小中大
如果胶中有小的裂隙，对转膜有影响吗？
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