蛋白质与蛋白组学

我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变性，再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。

另一个感觉就是样品中目的蛋白的量，限于WB的检测下限问题，一般目的蛋白量最好别低于1ng（虽然ECL法下限是0.1ng，即100pg），最好在10ng以上为好。这就要求在做WB之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度，最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量，千万别把样品搞稀了，否则就不好办了。

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师兄或师姐,你说的意思是直接把提取的蛋白液加入loading buffer煮沸变性后直接保存,然后蛋白电泳时直接拿出来上样就可以吗?那样保存可以吗?加入loading buffer 变性后的蛋白样放几度保存?四度就行还时-20或时-80度?
第二,你说的是加样量少可能检测不到,那么如果加样量非常多,对实验是不是也会又很大影响?

我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会
1、跑胶 电泳Buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个3－4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度；Buffer一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白；
2、转膜 我用的是湿转，Buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。
就这些了，请各位指正

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滤纸不要大过PVDF膜??哎,,到底滤纸,膜.胶的大小顺序是什么啊 怎么每个人说法都不一样啊

谢谢战友！我的感觉是电泳跑胶时buffer的利用，如果蛋白跑出胶外，那下次一定就要更换，如果没有的话还能用一两次．

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什么叫蛋白跑出胶外呢?我每次都把兰色那条带跑出胶,蓝色那条跑到快底部,那算是蛋白跑出胶外吗?我的蛋白样是组织提取液

换成了薄的滤纸（两侧各三张），自从换了这个以后就一直有问题了，正对照也很难做出来。

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滤纸用的张数对转膜有很大的影响吗?