蛋白质与蛋白组学

滤纸用的张数对转膜有很大的影响吗?

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我也觉得没有影响，但现在就是非常奇怪。

湿法转移转移的确从来没什么短路的情况，半干转移才要特别注意，不过后者基本上不用，我们做了比较的，稳定性和重复性前者要好得多，当然对于高手来说也无所谓，但我觉得能做湿法的尽量还是用湿法。

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1. 这种情况下我们通常会同时跑两块胶（或者一块胶切成两半），一块染色一块做Western，同步试验才能确保电泳没有问题，不知道你是不是这样做的。
2. 转膜我们一直用的25mM tris 192mM Glycine 15%甲醇（两次一换），各个实验室会用一套比较成熟的系统，如果你们的系统一直很好我觉得你的buffer你也不用怀疑它，只不过要注意check一下你的PH值。一旦摸索出较好的系统后不要轻易更换所使用的试剂厂家。
3. “考马斯亮蓝染色，干干净净，PVDF膜用丽春红染色，也什么也看不到”
的确，73KD这种条件下不会转过，所以我觉得是不是你的电极插线或者是做三明治的夹具放反了，全部转到缓冲液中去了，滤纸不会有什么问题，两种都可以，我们在没有厚的专用滤纸前一直用的是3张普通滤纸。
4. 没有用过的抗体最好有阳性对照，甚至我们每次做都会使用阳性对照，确保我们在出了问题能迅速找到原因
如果手头没有什么成熟的western体系可以向各个做抗体的大公司索要，这些体系都非常常熟，自己练习两次就熟悉了。

1.每次我都是跑一份平行的SDS-PAGE考染的，一切正常。
2.你所说的buffer是半干法的buffer吧，这套湿转膜系统以前本实验室一直用的。
3.这个电极搞反或是三明治搞错是不可能的，我做过n次，以前都是好的，突然就不行了，一直到现在，我每次都仔细检查，若是偶尔一次还有可能，连续多次就不可能了。
4.我前面说了，正对照是有的，点杂交出来，就是western出不来。

湿法转移转移的确从来没什么短路的情况，半干转移才要特别注意，不过后者基本上不用，我们做了比较的，稳定性和重复性前者要好得多，当然对于高手来说也无所谓，但我觉得能做湿法的尽量还是用湿法。
1. 这种情况下我们通常会同时跑两块胶（或者一块胶切成两半），一块染色一块做Western，同步试验才能确保电泳没有问题，不知道你是不是这样做的。
2. 转膜我们一直用的25mM tris 192mM Glycine 15%甲醇（两次一换），各个实验室会用一套比较成熟的系统，如果你们的系统一直很好我觉得你的buffer你也不用怀疑它，只不过要注意check一下你的PH值。一旦摸索出较好的系统后不要轻易更换所使用的试剂厂家。
3. “考马斯亮蓝染色，干干净净，PVDF膜用丽春红染色，也什么也看不到”
的确，73KD这种条件下不会转过，所以我觉得是不是你的电极插线或者是做三明治的夹具放反了，全部转到缓冲液中去了，滤纸不会有什么问题，两种都可以，我们在没有厚的专用滤纸前一直用的是3张普通滤纸。
4. 没有用过的抗体最好有阳性对照，甚至我们每次做都会使用阳性对照，确保我们在出了问题能迅速找到原因
如果手头没有什么成熟的western体系可以向各个做抗体的大公司索要，这些体系都非常常熟，自己练习两次就熟悉了。

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1.每次我都是跑一份平行的SDS-PAGE考染的，一切正常。
2.你所说的buffer是半干法的buffer吧，这套湿转膜系统以前本实验室一直用的。
3.这个电极搞反或是三明治搞错是不可能的，我做过n次，以前都是好的，突然就不行了，一直到现在，我每次都仔细检查，若是偶尔一次还有可能，连续多次就不可能了。
4.我前面说了，正对照是有的，点杂交出来，就是western出不来。

但是蛋白制备,sds page,转膜我认为与个人操作有关,我的同界同学竟然把marker转到膜上后,发现目的蛋白还在胶上(不要怀疑,真的是这样,就是不知道为什么).

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你说marker 转到膜上了　目的蛋白还在胶上　这样的情况很正常啊
我们实验室很多师姐就遇到过这样的情况　她们做的蛋白大的时候好象尤其这样　最近我也有过这样的情况　做４２ＫＤ的蛋白还总是偶尔压片出来带时　转膜都是marker已经转没了　　
到是marker清晰可见在膜上时　多次还压不出带呢

我这几个月也做了十多次WB， 最大的感触就是提取高质量的蛋白很关键。

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那么你现在是否有提取高蛋白质量的方法呢？　分享一下吧
我看很多人似乎都用组织匀浆器来提取组织总蛋白
比如匀三秒停三秒　共匀１５秒　什么的
有的又提倡最好别用组织匀浆器　因为产热大　而且不易控制不起沫
我们实验室一直用玻璃匀浆器　迅速冰上进行
但是我自己做起来　总觉得＂迅速＂这两字做起来好难啊
尤其在组织剪碎不完全的情况下　最后发现组织块根本就匀不碎了
所以最后我得出的教训就是：一定要在匀浆之前把组织块充分匀碎

我做western开始条带不出来，但帮别人做的全部出来了，后来发现是一抗坏了，好容易说动老板重新买一抗，发现不能太帮老板省钱，要不辛苦倒霉的还是自己。
后来做stripper，开始的时候都能出来，后来一次偷懒，自己没配用了别人配的，结果就做不出来了，发现做实验一点不能马虎，东西最好全部自己配置，还要及时换新的。
western做多了，几个同时做，还出现过拿错二抗的事情，呵呵，当时就纳闷怎么很熟练的条件突然一点条带也没有了。

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想问你　你stripper 用的溶液与步骤？
谢谢