蛋白质与蛋白组学

做了几个月western了，总结下本人在western中遇见的一些问题：

听过一个讲座，说是在抗体中加叠氮钠，可以在4度保存，避免抗体的反复冻融。结果我就犯错误了，二抗也加叠氮钠了，导致发光显不出条带，找原因找了一周，才知道叠氮钠能抑制HRP的活性。

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我和你犯的错误一样啊！
以前做很成功，自从加了叠氮钠就连连失败，正怀疑是不是叠氮钠加的不好呢！
兄台，多谢提醒!

我最近一直在做，可是碰见一下问题向高手们请教，希望提点改正意见：
1 转膜时，多次出现小分子量的转膜效果不如中分子和大分子量的（用的彩虹MARKER，但14KD的亮黄色的条带仍然在胶上，转膜后的胶染色后小分子量区域的蛋白残留较多。在整张和将不同区域的分别转膜时均出现这种情况。）
2 在暗室里肉眼可以看见发光，可是胶片上一无所有。

3 ECL没有表达，可是用DAB时膜上却出现条带。

4 手工显影时，胶片的显影时间和温度有很大关系吗？显影的时间掌握如何比较恰当？

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2 这个现象在你的目的带好像不大可能，我们倒是在使用普利来的MARKER时出现过这种问题，在暗室可以看到MARKER发光，但是胶片上什么都没有，后来发现是marker在每次使用后需要在可见光下暴露片刻才可继续使用，否则虽然在暗处发光，但是不会让胶片感光的。

3 用DAB时膜上出现条带，说明你的蛋白转过去了，而且二抗也结合上了。如果ECL没有表达，是不是你的ECL发光剂过期了或者不够敏感呢？

4温度对显影影响不大。做western 你当然要做预实验摸一下条件了，包括一抗和二抗的浓度、显色时间。显影的时候以目的带比较清楚又不能太浓为宜，如果太浓，可能会看不出差异，尤其是在对内对照显影的时候，不要太浓，曝光浅些会比较漂亮。

湿法转移转移的确从来没什么短路的情况，半干转移才要特别注意，不过后者基本上不用，我们做了比较的，稳定性和重复性前者要好得多，当然对于高手来说也无所谓，但我觉得能做湿法的尽量还是用湿法。

1. 这种情况下我们通常会同时跑两块胶（或者一块胶切成两半），一块染色一块做Western，同步试验才能确保电泳没有问题，不知道你是不是这样做的。
2. 转膜我们一直用的25mM tris 192mM Glycine 15%甲醇（两次一换），各个实验室会用一套比较成熟的系统，如果你们的系统一直很好我觉得你的buffer你也不用怀疑它，只不过要注意check一下你的PH值。一旦摸索出较好的系统后不要轻易更换所使用的试剂厂家。
3. “考马斯亮蓝染色，干干净净，PVDF膜用丽春红染色，也什么也看不到”
的确，73KD这种条件下不会转过，所以我觉得是不是你的电极插线或者是做三明治的夹具放反了，全部转到缓冲液中去了，滤纸不会有什么问题，两种都可以，我们在没有厚的专用滤纸前一直用的是3张普通滤纸。
4. 没有用过的抗体最好有阳性对照，甚至我们每次做都会使用阳性对照，确保我们在出了问题能迅速找到原因
如果手头没有什么成熟的western体系可以向各个做抗体的大公司索要，这些体系都非常常熟，自己练习两次就熟悉了。

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我们实验室都是用半干转，重复性，稳定性都还很不错的说，只要不是人粗心的（电转液配错了，误把电泳液当成电转液用）结果，是不会轻易短路的，再说半干转省事，至少不用冷冻啊，呵呵，一般恒流80mA，1h－2h都可以，我试过，感觉一个半小时比2个小时还稍微好点（预染marker为证），还省时间，对了，最好用3mm厚的滤纸，怕转干了。再就是我们电转液是不重复使用的，因为每次用的也不多，用2个10cm直径的表面皿装转移液就可以了

我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会
1、跑胶 电泳Buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个3－4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度；Buffer一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白；
2、转膜 我用的是湿转，Buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。
就这些了，请各位指正

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transfer buffer可以在电泳上完样之后直接丢到-20度，等电泳完了就差不多了
滤纸我们天天都用大于PVDF膜的，不会短路。