蛋白质与蛋白组学

我最近一直在做，可是碰见一下问题向高手们请教，希望提点改正意见：
1 转膜时，多次出现小分子量的转膜效果不如中分子和大分子量的（用的彩虹MARKER，但14KD的亮黄色的条带仍然在胶上，转膜后的胶染色后小分子量区域的蛋白残留较多。在整张和将不同区域的分别转膜时均出现这种情况。）
2 在暗室里肉眼可以看见发光，可是胶片上一无所有。
3 ECL没有表达，可是用DAB时膜上却出现条带。
4 手工显影时，胶片的显影时间和温度有很大关系吗？显影的时间掌握如何比较恰当？

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dab可以显出目的条带说明流程没有问题。
而ecl敏感性应该更高反而没有出结果，表明问题出在化学发光法显色上。
A液和B液放置过久，里面所含过氧化氢可能会分解，请考虑是否问题出在这里，另外考虑显影液和定影液，以及显影时的操作时细节是否正确；DAB显影的话，应37度，ECL应该和温度没多大关系；DAB在37度显影一般5分钟内就可以出结果，ECL显影时间参照说明书。

求教各位高手，最近我的Western blot经常是出来干干净净，什么都没有，成功率低。经过SDS－PAGE胶考马斯亮蓝染色，证明电泳没有问题，蛋白也没有降解。用正对照蛋白做点杂交也证明一抗，二抗以及发色系统没有问题。
疑点就集中在转膜过程上，因为之前试验正对照蛋白（30KD）的时候用的转膜用的厚吸水纸用完了（“三明治”两侧各一张），换成了薄的滤纸（两侧各三张），自从换了这个以后就一直有问题了，即使正对照也很难做出来。我用的是湿转法，转膜buffer同《分子克隆》上：48mM Tris，39mM 甘氨酸，20％甲醇，0.0375%SDS，转膜条件：4度，200mA稳流一小时，我的蛋白比较大，73KD，这个条件是否合适？转膜结束之后将胶用考马斯亮蓝染色，干干净净，说明已经转走了，将PVDF膜用丽春红染色，也什么也看不到，感觉不太可能转过头，因为之前30KD的蛋白用这个条件也可以的。最近我又将转膜buffer的甲醇比例下调到15％，其他条件相同。结果也是一样失望，各位有什么建议么？

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我也碰到相同的问题了.最近我的蛋白老是转膜不上.已经连续做了3次了,我的蛋白是72Kd的.使用的电流是不超过300mA,电压是110V,转膜时间是1.5h,结果3次都是发现预染Marker没有转上NC膜,同时胶上的预染Marker也没有了,再对胶进行考马斯兰染色,和对膜进行丽春红染色都没条带,但是在做预实验的时候做成功的,当时也出了小插曲就是发现没有转上进行胶的考马斯兰染色见到条带,随后再进行了一次转膜就上去了.
现在不知道是电流电压的问题.还是什么其他的问题,请教有经验的前辈们指教一二,
今天开始准备同时样品跑2块胶.一块就做考马斯兰染色.一块电转.准备用12v低温4度冰箱电转过夜.再试试.如果还没转上.而考马斯兰有条带,就准备再用染色的胶转一次.真的不知道究竟湿转的电流电压和时间是怎样的.请有作过的给个建议!!
急等!!谢谢!!

我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变性，再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。

另一个感觉就是样品中目的蛋白的量，限于WB的检测下限问题，一般目的蛋白量最好别低于1ng（虽然ECL法下限是0.1ng，即100pg），最好在10ng以上为好。这就要求在做WB之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度，最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量，千万别把样品搞稀了，否则就不好办了。

最后，还是多看文献，在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的，有什么特殊要求，内参如何选等等。当然也包括多来丁香园学习~~：〉

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战友讲的好啊！！！。。。。。。
蛋白提取第一重要！第二就是抗体了！