蛋白质与蛋白组学

请问我做的是蛋白差异表达，但是现在做出来的结果是感觉不同组织的差异不是很大，可能是目的蛋白都显得深了，请问能有什么方法使目的蛋白显出来但又不是很深？
我自己想，一抗二抗的浓度和时间有没有关系？还是一抗的关系不大，而二抗的关系大？曝光的时间应该有关系，还有就是是不是加样量大一点差异会明显一点？
请问有没有高手能做较为系统的阐述？谢谢！

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1。蛋白上样量是多少，一般情况下，20-30ug总蛋白已足够了。
2。曝光/显影过深会掩盖掉蛋白浓度的差异，提高一抗或二抗的稀释度可以解决这个问题。
3。至于曝光时间，用Amersham ECL底物检测，如果曝光时间少于几十秒就可以显示出明显条带的话，说明蛋白量或一二抗过饱和了，可以减少用量。

我的蛋白是多肽，只有40个氨基酸，分子量也就大概几个kd，
请教各位，象这种蛋白在做western时该注意什么？转膜用半干还是湿转好呢？

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1。高浓度PAGE胶（15-20%）。
2。0.22um转印膜。（一般使用的是0.45um）
3。转移buffer中甲醇含量不要太低（15-20%）。
4。凝胶在转移buffer中平衡时间不要超过10min。

我们WB做过很多次，一直以来条件都很稳定，可现在不知道是天气变冷了还是怎么了，在ECL显影时，最初两三分钟条带还能肉眼看到，但很快就消失了，X光片显影也没有，请问各位高手这是什么原因呢？我们根据说明书得解释，尝试改变二抗的浓度，已经不同浓度都试过了，还是老样子，请问各位高手，指点一下？？？谢谢啦

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会不会是显影液温度太低？洗照片时显影液温度是挺关键的因素，洗胶片可能也是如此，我们实验室有空调，没遇到过这种情况。
条带肉眼可见，反应太强烈了，容易淬灭。