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标题:【讨论帖】成功过的战友讨论下，你曾经ＷＥＳＴＥＲＮ...

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-10-21 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
偶有个问题，至今一直不明白。
用天根的marker，在小梳子制孔时跑的还可以，
但在大梳子时就只能跑出一半的宽度，就是只有加样孔的一半宽，而且跑很难看，这是为什么？
用其他marker从未出现过这种情况。

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我也遇到过的，由于两侧lanes的样品加样可能偏多，会把marker向中间挤压的，形成变窄或不规则的泳道．可以稍微减少上样量试试．呵呵．
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2541[使用道具]
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发表于 2013-10-21 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这种可能是存在，我具体情况没说清楚。
我的上样量只有30ug,对大孔来说绝对不多，而且我同时用了另外一个marker，条带就很漂亮。天根的就只有一半加样孔的宽度。
不知道怎么回事。
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eric930[使用道具]
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发表于 2013-10-21 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果同样条件下天根的跑不过其它marker,那只能是marker本身的问题了.请高手指点下呢,呵呵。
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PCR[使用道具]
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发表于 2013-10-21 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请指教一下,
我做的心肌组织蛋白,共做了两张膜,除了一抗不一样外,其余条件完全一样(一个是actin,一个是troponin),结果很奇怪,actin那张膜上,背景清楚,但是条带很浅,有些孔看不见(我作了一个浓度梯度,6,3,1.5mg/ml).但是troponin那张膜上,背景比较重,非特异条带多得我都着不到目的条带了.我大致得条件是浓缩胶60V,分离胶100V,转膜350mA55分钟.ECL
我的一抗是SANTA CRUZ(两个都是1:1000)是不是不好?我的膜杂带多是不是也说明我的蛋白是有的,就是提蛋白,电泳,转移都没有大问题,但是为什么actin为什么会这么少?
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PCR[使用道具]
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发表于 2013-10-21 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有,抗体一般的使用期限是多久?
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nn255[使用道具]
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发表于 2013-10-21 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也作了好长时间western ， 一直有一个疑问，为什么我的western老师不稳定呢
ECL曝光老是一点亮光都没有，但有时候同样的条件，发光又很好
究竟是什么原因阿 百思不得其解
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发表于 2013-10-21 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也作了好长时间western ， 一直有一个疑问，为什么我的western老师不稳定呢
ECL曝光老是一点亮光都没有，但有时候同样的条件，发光又很好
究竟是什么原因阿 百思不得其解

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实验重复性有很多影响因素，每个环节每个细节都可能影响结果，在规范操作保证人为因素尽量一样的情况下，还应该注意的是一些试剂可能随着环境的变化效率或作用结果可能有改变，应该严格注意温度，PH等。
祝好运！
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sr9971[使用道具]
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发表于 2013-10-21 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有,抗体一般的使用期限是多久?

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我们实验室的经验是稀释一抗使用PBST+NaN3+BSA，进口原装抗体一般10次左右（或者更多）都没什么问题，但国产或者分装抗体要看运气如何。
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c86v[使用道具]
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发表于 2013-10-21 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
成功过的战友讨论下，你曾经ＷＥＳＴＥＲＮ做不出来是那部分出问题了．看看各部分出问题的几率，为还没有成功，仍然苦苦寻找结果的战友提供点参考（由于本人经验有限，不足之处还请斑竹和各位大侠改正）：

1、蛋白提取问题，蛋白降解，或者上样量少导致检测失败。
2、蛋白电泳失败。
3、转膜问题：转膜不充分，过转，温度过高导致蛋白结构改变等。
4、抗体问题。
5、显影问题。
6、其它。

请战友提供各部分问题的主要说明和对策，谢谢！祝丁香园蛋白版越来越旺！

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我跑完电泳用考马斯亮蓝染胶再用甲醇冰醋酸脱色，胶上什么都没有，什么原因呢?请大侠赐教！
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nn255[使用道具]
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发表于 2013-10-21 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以用考马斯亮蓝染胶　６h以上，然后水煮三遍看看，如果还是没有条带，就是蛋白样品的制备有问题．
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