蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】pET22b 诱导表达问题 加入IPTG工程菌生长很慢

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标题:【求助】pET22b 诱导表达问题 加入IPTG工程菌生长很慢

fox_79[使用道具]
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发表于 2013-10-22 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白中会不会有很多稀有密码子呢？
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发表于 2013-10-22 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看你表达的是什么蛋白，大部分膜蛋白，在菌体内能直接影响细胞代谢和信号传导通路的可溶蛋白基本上多少都有毒性。如果可溶表达量很少而且加入IPTG后生长停滞基本上可以肯定有毒。

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LB的话隔夜摇菌的OD大约是2，低温诱导一般是16-18度。
我用pET30表达就可以表达出来一个很明显的条带。同样的宿主菌，只是换个载体却不行了。我的蛋白也没有毒，用Pet22b的话乳糖诱导就可以生长很好，但是还是不表达。请问这个载体有关系吗?
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发表于 2013-10-22 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
会不会在包涵体里面，就是破碎细胞的沉淀里？

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那么怎么检测是不是有包涵体形成呢，如果有包涵体，破碎完离心之后包涵体和菌体碎片是混在一起的，该怎么分离呢
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发表于 2013-10-22 15:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问是怎么判断有毒性的呢？较高OD有没有具体点的值？低温到多少度呢？我也碰到了相同的问题，不过是pGEX-4T-1载体的，外插基因片段大概130kD，请问楼主的问题解决了吗？

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现在还在不不断尝试中，问题仍然没有解决……
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sistis[使用道具]
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发表于 2013-10-22 15:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那么怎么检测是不是有包涵体形成呢，如果有包涵体，破碎完离心之后包涵体和菌体碎片是混在一起的，该怎么分离呢

==================================

拿沉淀来进行SDS-PAGE，就和上清一样。
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2013-10-22 15:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的PET30A，一般我是摇到OD0.6那样再加终浓度0.5mM的IPTG的，前期让菌体长多点，后期长慢也无所谓了
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发表于 2013-10-22 15:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你有没有检测过你的片段插入后ORF对不对？
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2013-10-22 15:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般在加入诱导剂后，如果目的蛋白有表达的话，细菌的生长速度会减慢许多，我表达的大多数蛋白都是这样，有少数没有表达，也发生生长速度降低的情况，大多数外源蛋白放进早期非融合表达载体中的时候，如果不能表达，可以考虑采用novagen公司后来的融合表达载体，如thx系列，或nusa系列，或者ge公司的gst融合表达载体，往往能获得理想表达，因为蛋白表达跟mrna 5'端二级结构有密切关系，所以融合蛋白表达往往是比较终极的手段，如果你不愿意融合，可以考虑优化5'端的编码序列，有时能取得意想不到的结果，至少我成功过一次。希望对你有帮助。
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发表于 2013-10-22 15:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另外，诱导时机很重要，普通的摇菌过了1再诱导，表达量会明显下降。切忌。iptg浓度不需要摸，1mM就可以，温度可以试试，但低温一般可增加可溶的可能，如果是真核分泌蛋白，则低温长时间意义不大，即便是可溶的，也极有可能得到可溶性互聚物，凝胶过滤一看便知。希望对你有帮助。
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发表于 2013-10-22 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该是有毒性
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