蛋白质与蛋白组学

LZ好，感谢开此话题，从中学习到很多东西！
想问一下：1、买的Spin-X 8162的过滤管，上面是0.45um，这个应该不可以作为超滤管用吧？从理论上讲的话，一般WB用的硝酸纤维素膜也是0.45um的，蛋白也一般不会转过头，所以就问一下，谢谢！
2、有没有截留蛋白大小与孔径大小的那种对应关系？
3、超滤管最大的承受离心力为多大？是不是都不能超过6000rpm？
4、超滤管使用前需不需要做什么处理？用后如果再重复使用的话，有没有什么保存的注意事项？
5、买的milipore的15ml超滤管，截留分子10KDa，但是从浓缩的结果来看，总觉得损失好多，不知道是残留在膜上的太多，还是有滤出去的？
谢谢楼主！辛苦了！期待您的指点！

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1，用分子量计量标准的是超滤，比如1K,3K,5K,.....1000K.
用微米表示的是微滤，比如0.1um，0.2um，0.45um等。

2， 我曾经回答过，这个没有很明确的对应关系，况且蛋白的直径vs分子量，并不是和分子量有那样明确的的线性关系。在蛋白中心区，分子量的增加会导致直径增加比较快速，而当分子量再增加时候，蛋白直径增加变慢。蛋白的分子形状也会影响分子量。

3，在开篇附件里面有介绍，过滤指南里面有关于最大推荐离心力的表5， 可以参考。对于小的离心管，可以超过6000rpm。

4， 使用前用纯化水冲洗一下，去除一下易润湿液即可。离心管可以重复进样，但是膜不好反复使用。因为上一次的污染清洁如何，很难验证。

5，判断损失，您可以在下游取样看是否有漏过。是否在膜上，您可以再次清洗膜，看是否有洗出来的。不管怎样，总能找到损失的原因和目标蛋白的去向。并针对解决。

欢迎提问！

谢谢楼主的介绍和经验。
两个问题：
1，分子量和膜孔径的关系，你给出一个蛋白的粗约估计，90kd/1nm，不知有无出处？我们用激光动态光散射仪，DLS ( dynamic light scattering)，测得单链抗体分子量约42kd，分子直径约3nm; 90kd的约为4nm.
2. 微滤膜和超滤膜的清洗，也就是如何重复使用。一是这些滤器贵但质量不错，值得重复使用；二是环保，减少塑料垃圾。当然厂家不会高兴，你越浪费他们越高兴。广州一家公司说是可以提供专用清洗液，号称微孔滤器可重复使用十次以上，也不知真假。不知楼主有无经验？

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1，这个完全有可能。在那个微观水平讨论的尺寸，本身就面临很大挑战。如果有工具实测分子大小，那实测的可以 作为参考。 所以我反复强调，这个事很粗的参考。
2，您的意见很好。在不是要求很严格的情况下，如果寻求到清洗的办法，反复使用是 值得考虑的。至于厂家是否高兴，那个管不了太多。但是反复使用有清洗验证的挑战。对于不同的材质经历的不同蛋白污染，清洗条件是不一样的。

你好。我想请问下问题。我现在用超滤管直接浓缩我的水稻根系分泌物中的蛋白样品，对于其中所含的糖类以及一些小分子盐类能不能都除去？还有，超滤到最后一般要按什么比例进行洗滤，是不是洗的多了会损失蛋白？ 如果我只是用水溶解蛋白的话，会不会造成蛋白凝集？谢谢啦。

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选择合适分子量的膜孔可以达到浓缩蛋白去除小分子盐和糖。洗滤可以加等量的缓冲液或者水。只要分子量选择合适，蛋白不会损失。会不会造成蛋白凝集，需要看您的蛋白的特性。

不客气。

LZ好，想问一下：哪种材质的超滤器可以高压？

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PES不可以高压。70%乙醇或者一些气体可以灭菌。具体见指南。

以前有用过MILLI 30K的，超滤完后发现30K以下的还是很多，理论上是不是30K以下的要基本上滤出？

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其实用膜包在挤压过程中，一定会造成过滤孔径变形，那么直接影响的就是过滤品质，这是其一。
另外产品的分子结构在至目前的经验中，感觉也会对过滤品质造成影响，并不能达到完全滤出。
比如分子呈长线链装结构时，在过滤时受压，也会出现堵塞膜孔现象。
因此，应该是根据需要选用不同的膜来进行处理，那么效果会完全不一样，然后再进行比对来进行选择。
单说MILLI不行也不一定。同类分子量级的中空纤维膜也可以试试看的。

我想分离两个蛋白，分别大小为22和45kd左右，目标是纯化22kd的，请问我要用多大孔径的膜？

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如果单单是球状蛋白的话，理论上直接采用30KD的膜即可。 取决于膜的分子切割精度。但是在具体的工况中，由于两者的分子量过于接近，有可能比较困难。

水通量Flux，是指在一定的温度（比如说25摄氏度）和一定的压力下（比如说1Bar），单位面积的膜单位时间（一般一小时计）透过的水的量。
Flux= XX LMH@25C*1Bar

注意水通量有新膜水通量和恢复水通量。前者是第一次使用前的新膜测定得出的水通量，这个数值测定后作为该膜用后清洗恢复率的水通量标准。恢复水通量是指用过的膜经过清洗之后，测定膜的水通量，并计算恢复百分比。一般该百分比不能小于80%。

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补充一下，还有一个同一温度的条件下。

我想请教在用超滤膜进行血浆蛋白结合实验时，离心机转速在12000rpm时，血浆不能完全滤过，该采取怎样的方法进行改进？我用的超滤管是30k的

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超滤分离蛋白质和小分子，必须洗滤，因为超滤是蛋白质浓缩过程而不像固液分离那么完全。血浆蛋白质浓度很高，需要多次洗滤。不断洗滤就会稀释小分子浓度，很难测定。最好的方法是沉淀蛋白质，离心分离。常用的沉淀剂有乙醇、PEG等，你可以根据是否影响药物测定来选择。沉淀剂加到一定浓度就可以基本完全沉淀蛋白质，乙醇可以通过蒸馏、抽真空、旋转蒸发、冻干再溶解等不同的方法去除。我是做血液制品的，有问题联系我。