蛋白质与蛋白组学

楼主，您好！
我做的结肠癌SW480细胞上清液的浓缩。具体的做法是，10mm皿细胞长到70%汇合时，撤血清，以无血清的L-15培养基培养20小时后取上清，经过离心，0.22um过滤后，将每皿10mL，共20mL的上清加到corning20ML，cut off：5K，超滤浓缩管中浓缩至1mL，加入生理盐水后混匀，继续离心3次，直到酚红的颜色退掉，浓缩至0.75mL。用BCA试剂盒测蛋白浓度为：0.7ug/uL。请问，您觉得这个浓度低吗？我的操作有什么问题吗？
谢谢！

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我的粗略的看法如下：这个浓度不算低，还可以。当然如果您能够更进一步浓缩，当然更好。
还是请有经验的人回答。再次致歉！

楼主的专业知识让人佩服！

我想请教两个问题，关于过滤和微滤的。

1、猪肝研磨后的悬浆不离心只过滤，大体应该使用什么设备和怎样设计步骤呢？
几年前我研发这个猪肝提取RNA项目，过滤就是一个重大阻碍。猪肝研磨后一些粗大的组织很容易去除，到了5μm级别就很难过滤了。借用别人的三足式离心过滤机效果也一般。我们的考虑是不购买大容量离心机，所以只能单纯考虑过滤方案。

2、蛇毒蛋白溶液经2300g离心后再过0.45μm滤膜，用抽滤瓶负压过滤，需要频繁换膜且速度很慢。是不是可以加一些助滤剂帮助过滤呢，还是在离心步骤之前加一些能帮助小颗粒沉淀的物质？
最终目的就是要缩短整个离心、过滤的时间而且损失的蛋白要少。

谢谢关注
祝顺

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您好！谢谢来访！
关于您的问题，我认为不妨试验一下方法：
1，用切向流的技术试试。小体积用离心管，大体积用大面积的膜。
2， 同样可以试试切向流，或者选择合适的膜，个人认为您的膜选择可能有问题。

请问超滤膜包使用一段时间后是否会发生膜包分子截留量的变化，就是原来能截留30k蛋白的膜包 会不会变成只能截留50K的蛋白的膜包了，以前使用过millipore的TFF的膜包 发现同样的30K 旧的和新的会不一样，如果有为何会出现这样的情况，谢谢


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您是对的。超滤膜随着使用的时间推移，会产生孔径逐渐变大的情况。所以新膜和旧膜不宜混用。
原因吗，使用过的膜孔径当然会变大，生活中很多这样的现象。

楼主你好，
请问超滤管可以用来提取exosome吗？我在做肿瘤细胞exosome(直径约30-200nm的膜小体)相关的实验，需要对用肿瘤细胞培养基来提取exosome。文献上一般是采用是分级离心法来浓缩，但是很耗时，而且实验室没有超速离心机，请问可不可以采用超滤离心的方法来提取exosome？急盼回复，万分谢谢！！！

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分离纯化有多种方法，原理之一是SIZE的大小。那么size也有2种，一种是分子筛，一种是密度梯度离心。前者的应用是膜法分离，就是现在的离心管式，后者是根据密度梯度--但是需要专门的离心机。
用膜法当然是可以的，您可以浓缩，可以分级分离，可能效率如何是需要看杂质和目标物的差别大小。
在您的粒子的孔径范围里面选择，原则还是前文讨论过的。

如果单单是球状蛋白的话，理论上直接采用30KD的膜即可。 取决于膜的分子切割精度。但是在具体的工况中，由于两者的分子量过于接近，有可能比较困难。

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只是理论上可以，参照供应商关于30kd的定义，可以发现它是没法分离22kd和45kd蛋白的。