【转帖】从纯化到星辰---冷泉港(CSHL)蛋白质纯化... - 经验共享

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标题:【转帖】从纯化到星辰---冷泉港(CSHL)蛋白质纯化...

moonlight45[使用道具]
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发表于 2013-10-25 23:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

推荐的第二本书《Purifying Proteins for Proteomics :A Laboratory Manual》，看起来很诱人的说。
Preface
Purifying Proteins for Proteomics Companion Web Site
Section ⅠTonguereparing Proteins for Proteomic Analysis
1 Role of Separation Science in Proteomics
2 Strategies for Purifying Proteins
Section Ⅱ:Chromatographic Methods for Preparing Proteins for Proteomics
3 Introduction to Chromatographic Methods for Protein and Peptide Purification
4 Multidimensional Chromatography of intact Proteins
5 High-throughput Screening of Soluble Recombinant Proteins
6 lon-exchange Chromatography
7 Size-exclusion Chromatography
8 Role of Reversed-phase High-performance Liquid Chromatography in Protein Isolation and Purification
9 Hydrophobic Interaction Chromatography
10 Affinity and Immunoaffinity Chromatography
11 Dye-Ligand Affinity Chromatography in Proteomic Research
12 Immobilized Metal-ion Affinity Chromatography
13 Protein Chromatography on Hydroxyapatite
14 Chromatofocusing
Section Ⅲ:Electrophoretic Methods for Preparing Proteins for Proteomics
15 Introduction to Strategies Based on Electrophoresis for Separating Proteins
16 Separation of Proteins Using Two-dimensional Gel Electrophoresis
17 Sample Preparation for High-resolution Two-dimensional Electrophoresis by Isoelectric Fractionation in a MCE
18 An Electrophoresis Method for Purifying Proteins:The Gradiflow BF400 Instrument
19 Protein Purification Using Free-flow Electrophoresis
Section Ⅳ:Analysis of Purified Proteins Prior to Structural Proteomics
20 Introduction to Methods for Characterizing Purified Proteins
21 Characterization of Proteins by Mass Spectrometry
22 Analytical UltracentrifugationTonguerotein Size,Conformation,and Interactions
23 Measuring the Conformational Stability of a Protein
24 Combining Surface Plasmon Resonance with Mass Spectrometry:ldentifying Binding Partners and Characterizing Interactions
25 Analysis of Carbohydrate from Glycoproteins
Appendices
1.An Overview of Protein Structure
2.Measuring the Concentration of Proteins
3.Concentrating Solutions of Proteins
4.Stabilization of Proteins for Storage
5.One-dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis
6.Troubleshooting Guides
7.Cautions
Index

要是哪里有for free的电子版就好了！Big Smile

831226[使用道具]
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发表于 2013-10-25 23:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这两本书都太贵了。。。
买不起啊
我在日本，可以在网上买到这两本书
可是价格，我以便宜的那种软皮的算
第一个是7000日元左右
第二个是20000日元左右
太贵了，我刚买了本生化词典，10000多，心疼死了。。。
怎么办啊？？？
好像没看到图书馆有着两本书。。。

雪山飞鹿[使用道具]
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发表于 2013-10-25 23:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

昨天刚买了一本《蛋白质纯化与鉴定实验指南》，觉得这种讲策略和技术的书实在很好，至于色谱说的《Purifying Proteins for Proteomics :A Laboratory Manual》这本书十分感兴趣，不知哪里有卖的？

zwsyrt[使用道具]
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发表于 2013-10-25 23:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（十）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Wed May 11 20:43:26 2005) WWW-POST

本文献给YL

（十）永远的转录因子
　　　
　第一个模块的实验结束以后，我们进入第二个模块的实验。这个实验的指导教授叫叫Al Courey?
这个模块的实验主要是要从Hela细胞里纯化AP-1。AP-1是一种很重要的sequence specific鬃?家?
子，在很多生理过程里都有作用。AP-1其实不是一种均一的蛋白质，实际上一种二聚体结构构，要?
是Jun-Jun 或者是Jun-Fos dimer。Jun和Fos都是alpha helix的结构。Helix的一边有很多LLeu,和
另一个helix形成Leucine Zipper的结构，而helix另一边就是碱性的氨基酸居多，所以可以以和DN
结合。这个转录因子看起来就象一双筷子夹着DNA。
　 sequence specific转录因子是极其重要的一类蛋白质，真核生物的基因有5~10%是佑美编码
这种蛋白的。这个模块涉及的一些实验是最经典的一些分离转录因子的方法，所以很有用。

　怎么才能分离纯化呢？首先要确定要纯化什么因子，换句话说就是要决定纯化跟什么
匾霥NA
序列相结合的转录因子。决定了这个，才能有一个活性检测系统，才能真正开始纯化。另外
是，
可以把这种特异序列的DNA固定在柱子上，然后做亲合层析，纯化效率会非常高。
　整个纯化过程是这样的：首先制备Hela细胞的核提取物，然后用蛩岚背恋的办法粗?
一下组分，
小分子量蛋白(比如Histone H1) 因为无法沉淀而被去掉。到这里比活力会增加到原来的2倍
然后粗
分的产物再跑一下凝胶过滤层析，比活力再提高到初始产物的5到10倍。凝胶过滤的产物再?
DNA
affinity column, 比活力从5-10倍一下子提到了50~100倍。到了这一步，AP-1可以占到蛋?
量的
10~50%。
值得一提的是这个凝胶过滤层析。我们用的是Sephacryl S-300 HR 凝胶(一种聚
??０纺??，这种凝胶分辨范围大概是10KDa到几千KDa，但是这种凝胶是比较粗的一种?
质，
分辨率不能跟superdex之类的比。大概由于不是那么精细，所以可以自己手工装柱，我们用
闹?
子是Amersham的XK26/40(直径2.6cm, 高度40cm）。装好的柱子分辨率真的是很低，AP-1的?

脱体积跟空体积(void volume）相差挺小，而AP-1只有40~50KD已经很小了。这样一来很多?
白
根本没可能和AP-1分开！这也就是为什么这一步纯化倍数很小的原因。这样一来，为什么要
哉衣?
烦做这又贵又麻烦的一步呢？原因在于这一步可以去掉核提取物里面的酸酶，所以如果直
优?
DNA affinity column, column上的DNA Oligos会被降解掉！另外一个原因是，核提取物有?
些
可以和DNA非特异结合的蛋白，这些蛋白会饱和DNA affinity column，影响要转录因子的纯
??
这个纯化步骤说明，不同的纯化手段必须加以精心组合才会有最好的效果。

zwsyrt[使用道具]
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发表于 2013-10-25 23:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（十一）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Mon May 16 14:19:57 2005) WWW-POST

　本文献给YL

（十一）核抽提物

上回谈到纯化AP-1转录因子的大致流程。其实在过柱子之前的核抽提物的准备
也是十分关键的。从天然产物中纯化蛋白，如果大概知道蛋白在什么细胞器官，把
细胞器先分离出来作为纯化的起始原料，可以省好多事情。因为细胞器官的分离的
方法已经很成熟了。
　『顺提物是怎么准备?呢？首先，融解Hela细胞。我们在这个模块用的细胞都不
是自己长的，而是直接从一个公司Biovest 买来的。据说这个公司有NIH的补贴，
所以价钱不贵。一升media的Hela细胞才要１７刀。冻存在-80度的hela泡在有
glycerol的buffer里面，第一件事情就是要用有镁离子的PBS来冲洗几遍。然后用
一种低渗buffer来重悬细胞。这种低渗buffer盐浓度很低，所以由于渗透压的影响，
hela细胞膜会变得比较脆弱。这个时候呢，把重悬的细胞用Dounce 匀浆器处理一
下,把细胞膜弄破。低渗buffer里头虽然盐浓度很低，但也不是没有盐在里面。主要
有两种成分，一个是10mM KCl ,另一个是 1.5mM MgCl2。KCl没有什么好说的，
可以换成NaCl。MgCl2 就关键多了。镁离子可以稳定细胞核, 让细胞核不至于在破
碎细胞的时候就破裂。当然说是这么说，一些转录因子还是可能在匀浆的过程就漏出
来。细胞膜破碎之后，细胞核还是基本完整的，细胞质里面ER , Golgi之类的东东都
漏出来了。然后再来一个低速离心。细胞核是比较重的，所以一离心，马上就沉淀下
来了。而其他细胞质或者细胞膜的成分比较轻一些，还留在上清里面。
　　现在想起来，细胞器官的分离，几乎无一例外都是利用细胞器比重不一样来分离的。细胞核是最好分离的了，因为比其他的膜结构重得多。有些细胞器，比如要把Golgi 和ER分开，是个十分麻烦的事情，因为比重相差太小了。有些时候，可以用一些古怪的办法来分离。比如lysosome把，比重和线粒体及过氧化酶体很相近。一种办法就是往一堆无辜的耗子注射一种特殊的去垢剂叫Triton WR1339。耗子根本不能分解吸收这种化合物，就积累在肝脏细胞的lysosome里面，使得lysosome比重变轻了一些，这样就可以把 lysosome从mitonchondria和peroxysome分出来了。话扯远了，现在再回到AP-1purificatio 。
　　细胞核虽然被沉淀下来了，但里面还有很多染色质,　如果DNA都降解漏出来，麻烦就大
恕?
所以下一步就是用高盐buffer(0.42M KCl)来破碎细胞核。核膜，染色质之类的垃圾不能溶?
，
转录因子之类的蛋白却能溶解。再一离心，取上清就行了。我们要的转炉因子就在这里面。
蠢?
说，到这一步就可以上柱子了，但是这种上清溶液里面还有不少histone H1，可以抑制体外
?
录反应。为了祛除hisone, 我们又做了一步蛩岚背恋恚琱istone由于太小，沉淀不下来，?
转录因子什么的都可以被沉淀下来。沉淀重悬一下就可以跑Sephacryl S-300 的柱子了。　　

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发表于 2013-10-25 23:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

分子筛用短粗的柱子而不是细长的，4万多分子量的蛋白用s300而不是superdex75，都是些非常低级的常识性错误。
不要被冷泉港三个字吓倒了。

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发表于 2013-10-26 19:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Purifying Proteins for Proteomics :A Laboratory Manual
这本书武汉那里有卖的

zwsyrt[使用道具]
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发表于 2013-10-26 19:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（十二）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Tue May 17 20:02:58 2005) WWW-POST

　本文献给YL

（十二）Gel filtration的先天缺陷

　　　上一篇讲到核提取物。实验的下一步就是跑Sephacryl S-300 column。
这一步实验是整个课程中第一次跑凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography)，
我感觉还是很激动的。Gel filtration 是色谱中及其重要的一个种类。我先来谈谈
原理把。Gel filtration柱的材料是由高分子聚合物做的微珠。这些微珠呢，并不是
实心的，而是有很多孔状结构。当蛋白质样品经过这些微珠的时候，如果蛋白质分
子体积太大，不能通过微珠的孔状结构，就会绕过微珠，很快的被洗脱下来。如果
蛋白质分子体积不是那么大，可以通过微珠的孔状结构，就会迟一些被洗脱下来。
这样，蛋白质分子可以根据大小而被gel filtration column分开。
Gel filtration 和其他色谱方法一个显著的不同是：Gel filtration 并不依赖
蛋白质分子与柱材料的结合来分离蛋白。这个特点的一个好处是，所有的蛋白样品
最后都能被洗脱下来，柱子重复用也不会有什么问题。但是这个特点也给Gel filtration
带来了一个严重的缺陷：低分辨率。分辨率包括两个因素，一个是两个蛋白峰的距离，
另一个是，蛋白峰的宽度。由于蛋白在gel filtration column里面并不与柱材料相互结合?
所以很容易扩散(diffusion)，扩散的结果就是蛋白峰非常宽。这个宽度非常要命，很多

时候即使用了很好的柱子，蛋白顶峰也大致能分开, 但是由于蛋白峰太宽，重叠在一起，
这样就很难分干净。另外，两个不同大小蛋白的洗脱体积的差别与分子量差别的对数呈
线性关系，所以可以想见，如果分子量相近（比如只差两三倍）的话，洗脱位置也会相
近，Gel filtration是很难把两个蛋白完全分开的。
　　说一件我的糗事。有一次一个师妹遇到了一个难题，表达一个GST-tagged的蛋白
有一个降解产物。她想要的蛋白50kD,而那个降解的产物有30KD。她问我该怎么分开。
我没仔细想，就告诉她用Gel filtration。现在想起来，这实在是个昏招。当然，欣慰的
是，该师妹最终没有试gel filtration, 用别的方法解决了这个问题。Smile　
如果要想蛋白峰宽度变窄一点，怎么办呢？就样品而言，体积越小越好，理想状况是
小于柱体积的２％。就柱子的材料而言，最主要的就是得把微珠做小一些，这样空体积就
会小一些，扩散就不会那么严重。另外柱子里的微珠大小均匀一些也会有帮助。这种改进
带来的一个问题就是，需要用FPLC之类的设备提供较高的压力, 柱子才跑得动。另外分辨
率好的柱子往往不能手工装，得买预装的柱子，这样就很贵（很贵很贵！！！）。
唠叨了一大堆，我想表达的一个中心意思就是：如果你想从一个蛋白质混合物很干
净的把一个蛋白纯化出来，Gel filtration是肯定没戏的。
虽然gel filtration 不能很精细的纯化蛋白，但是它还有另两个非常重要的用途。
?
个是脱盐，另一个是确定蛋白大小。这两个用途是其他种类的色谱没法作到的。

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标题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（十三）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Thu May 19 01:29:29 2005) WWW-POST

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　（十三）装柱子的学问。

　上篇提到了Gel filtration的基本原理，现在谈谈我装柱子的过程。我们用的是Amersham 的 XK26/40的空柱子，然后往里面填充Sephacryl S-300 HR 的resin。按道理说，要提高分辨率，柱子应该是越长越细才好，这种柱子虽然不短，但是挺粗的。但是一个好处就是，样品体积可以大一些。
　　装柱子本身就是一件很tricky的事情，以至与这课的教程上专门列了一小节来解释怎么装柱子。我们这一组人中，我负责装柱子。一开始就是洗resin了，用粗制烧结玻板过滤的漏斗来洗，感觉这方法还挺快的。洗完了，就把resin重悬成50%的slurry，然后就是往柱子里头倒了。
但是呢，有一个小窍门，就是必须先封闭柱子的下出口，往柱子里面倒10%体积的buffer。
我过去装柱子犯傻，不知道要这么做，结果发现下面的resin 不均匀不说，还有一大堆气泡。所以先加buffer是很必要的。倒slurry的时候还得用玻棒引流，这样可以尽可能的避免气泡。
然后就是等了，等resin 沉降３０分钟后，就可以打开柱子的下出液口，让多余的缓冲液流出去。液面
低到靠近柱面的时候呢，就可以把上端液流接头接到柱子上方。这个过程最麻烦了，主要是不能引入气泡，所以先得让这个接头装置里面充满缓冲夜，把气泡赶出来。我第一次做没经验，费了九牛二虎之力才搞定了。然后就是接上蠕动泵(peristaltic pump) 加压，让resin继续紧缩一下。随着柱面的下降，接头装置还得不断往下移动，使得接头刚刚好与柱面接触。接触
不紧密的话，等于是冲淡了样品，分辨率会降低。
　　柱子装好了，但还不能开始跑样品。为什么呢？因为这种柱子的质量必须很好才能起到分离蛋白的效果，否则是根本没法work的。所以呢，首先得测试这个柱子是否真的装好了。
测试
过程很简单，就是跑一下蓝色葡聚糖(blue dextran)，蓝色葡聚糖是带有蓝色染料的多糖高分子聚合体，体积非常大，所以在空体积(void volume)就会洗脱出来。跑蓝色葡聚糖可以起到三个目的。第一个就是确定void volume，知道这个空体积是很重要的。因为每次装柱子，实际resin 的总体积都会有微小的不同。特定蛋白在柱子的洗脱体积与空体积的比值是一定的，所以只要知道了空体积，就能知道蛋白大概会在什么时候洗脱出来。第二个就是确定样品会被稀释多少。第三个呢，是柱子是否装的均匀。如果装的不均匀，葡聚糖j就会跑得形状怪异。一般来说呢，柱子
下端堆积会比上端均匀，为了分辨度好，应该从更均匀的一端上样。所以我们在做的时候，是从下端上样的。
　　忙活了半天，当所有装置都装好的时候，感觉还是挺兴奋的。首先是蠕动泵，然后是柱子，然后是UV monitor加记录仪。整套装置不贵，功能却很齐全。

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birdfish[使用道具]
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发表于 2013-10-26 19:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不错，Gel filtration分离效果是一般，经常有人很有毅力跑根本分不开的Gel filtration做纯化，我用Gel filtration只有一种情况，那就是一个在外水体积，一个在内水体积，如果不是这样的情况我会尽量不用这样的方法，虽然看起来30kD和50KD是大家都在内水体积是分不开，但是如果选择合适的填料刚好30KD在内水体积，50KD的在外水体积，这并非不可能，我现在能作到的就是凝胶过滤填料可以设计孔径，这样就以控制孔径大小，做类似G50但是孔径又稍微大点，这样可以也许可以使30kD在内水体积，而50在外水体积。因此我觉得缺陷还在于凝胶过滤填料的型号少，范围宽，自然分离效果也差。可选择余地太少。

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