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标题:【转帖】从纯化到星辰---冷泉港(CSHL)蛋白质纯化...

小荷尖尖[使用道具]
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发表于 2013-10-26 19:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

唉，真是及时雨啊，我曾经装凝胶柱，那么大一根，装了拆拆了装，只是用丙酮测柱效，没有用蓝色葡聚糖测，从而不知道外水体积，但是可以知道内水体积，知道最小的峰大概在什么时候出来而已；不过我是用的蠕动泵装柱的，测柱效时比较过从底端进样和从顶端进样，但发现从顶端进样比从低端进样高2000多个理论踏板数，不知为什么我的柱子跟你的不同：）；我自己添的柱子可以区分14，21，32，43，66，94kd分子量的蛋白，，：）94和66kd的蛋白基线分离，其他的好似五个手指头峰，，我自己还是比较满意的，，shying，，，但是，觉得凝胶一个最大的坏处就是稀释样品，而且不加盐确实分离度不好，最大的好处就是可以大概知道分子量的位置，在没有标准品的时候找到目的峰更有针对性，，呵呵，各位大侠跟前卖弄了
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发表于 2013-10-26 20:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 小荷尖尖 于 2013-10-26 19:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

唉，真是及时雨啊，我曾经装凝胶柱，那么大一根，装了拆拆了装，只是用丙酮测柱效，没有用蓝色葡聚糖测，从而不知道外水体积，但是可以知道内水体积，知道最小的峰大概在什么时候出来而已；不过我是用的蠕动泵装柱的，测柱效时比较过从底 ...

有人认为gelfitration不好用，那是因为他自己的柱子装的不好，或者没有试过长的预装柱，或者象这位冷泉港的老兄一样，装分子筛柱子不用装柱器。

你装的柱子柱效已经非常棒了，比有些预装柱还好，上次法玛西亚的工程师来给我们装了一根16/100的s200柱子，柱效才8000，效果很一般。我觉得你完全可以取代那位工程师了。

不知道你装柱的条件是什么，能详细说说吗？比如什么填料？多大柱子，蠕动泵装柱是怎么操作的，有没有用那种漏斗状的装柱器？请多指教。

你说的样品稀释，现在超滤管很方便，样品浓缩一两个小时就完成了。buffer不加盐肯定不行，加盐抑制填料的吸附作用当然地球人都知道。你一般加多少？
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发表于 2013-10-26 20:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yychen 于 2013-10-26 20:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


有人认为gelfitration不好用，那是因为他自己的柱子装的不好，或者没有试过长的预装柱，或者象这位冷泉港的老兄一样，装分子筛柱子不用装柱器。

你装的柱子柱效已经非常棒了，比有些预装柱还好，上次法玛西亚的工程师来给我们 ...

多谢您的夸奖，我是新人，蛋白质纯化这一块还得向前辈们学习，毕竟好多经验都是在长期试验中积累的。我装过16/40、16/60、16/100的superdex75的柱子，都使用了装柱器，用丙酮测柱效在10000以上，特别是16/100的柱子不好装，因为找不到法玛西亚关于这么长柱子的装柱资料，只能自己摸索着来了，，我觉得倒胶什么的就是按照说明书操作就行了，，关键是倒完胶后以低流速等待胶沉降完全一定不能心急，说明书上对于16/60的柱子说2－3个小时至胶面不再下降，我一般都是低流速沉降过夜，另外高流速进一步压实柱面我也用了比说明书高的流速，主要是看压力不超过柱子的耐受就行了，压的时间也比说明书上的长，具体时间根据装完柱以后的As值来判断。。还有就是我在柱子两端用了HR柱子上用的滤片，就是那种白色的小圆片，工程师说垫上这个对柱效没用，却会增大压力，我却发现用处挺大的，加了垫片柱效才上到1万的，我猜它可能可以使样品更均匀地分布到柱头，，可是当初却是害怕漏胶才垫上的，我在两端都加了滤片，压力真的并没有因此增大。

大家有什么经验和感触真希望能象arlbor一样不辞劳苦地贴出来，他人的成功或失败都可以使我们少走弯路，对吗？
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发表于 2013-10-26 20:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 小荷尖尖 于 2013-10-26 20:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


多谢您的夸奖，我是新人，蛋白质纯化这一块还得向前辈们学习，毕竟好多经验都是在长期试验中积累的。我装过16/40、16/60、16/100的superdex75的柱子，都使用了装柱器，用丙酮测柱效在10000以上，特别是16/100的柱子不好装，因为 ...

听君一席言，启发很大啊。
你用单独的泵还是fplc上的泵？如果是单独的泵怎么看压力？fplc的话，我不敢让fplc没人看着跑过夜。
滤片是个好办法，我想试试。不过我用的国产的上海锦华的柱子，没有带滤片，这种滤片法码西亚有卖吗？

成功的经验当然越多越好啊，不过有问题还是要指出来，不然误导新同学了就不好了。
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发表于 2013-10-26 20:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们的机器是AKTA purifier100，泵的型号是p-900，稳定性非常好，我的柱子最大到16/100走1ml/min的流速压力都是0MPa，所以我才敢低流速过夜的，在高流速压实柱面的时候因为我用了比说明书更高的压力，所以是寸步不敢离开，紧盯着泵上的压力数，呵呵，也挺担心。选择这么高的压力主要是因为As值总是提示高流速压实柱面时，压力不够，因此峰的对称性不好，提高这个时段的压力，As值就好多了。如果柱子装的不均匀，那么冲的时间越长压力才越高，我在机器上设了个压力高限，就可以放心睡觉去了。
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发表于 2013-10-26 20:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有，那个滤片法玛西亚有卖的，叫做filter kit，是一个小塑料袋装了好多个白色的滤片，你可以看看产品手册选择和柱子内径大小一致的滤片，价格不清楚
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发表于 2013-10-26 20:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（十四）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Fri May 27 18:25:41 2005) WWW-POST


　本文献给YL

　（十四）anfinsen的疑虑
　
　　跑完sephacryl柱子，组分就可以过DNA affinity column。DNA affinity column虽然汉苤?
要，但是这一步技术上来说要求很低。买来CNBR活化好的agarose，然后让特定序列的寡聚?
苷酸固定上去就行了，柱子也是最简单便宜的一次性柱子。
　 亲合层析是目前最常用也最强大的一种蛋白质纯化技术, 纯化效率比别的层析方法可以父 出一 两个数量级。这种方法诞生是六十年代的事情。当时是在NIH的Anfinsen实验室。Anfinsen适且?
个 当 尔奖获得者，可以说是蛋白质?叠研究的老祖宗。他主要 毕资 通过研究ribonucleaase 的 变性和重折叠证明氨基酸序列就可以决定蛋白质最后的三维结构。他实验室那时侯有一个学学生?
个project是从葡萄球菌里面提取大量 酸酶，然后研究enzyme-inhibitor interaction。?

个纯 化可是很麻烦的事情，用gel filtration, ion-exchange, hydrophobic interaction,　效
识己?
低。有人可能会问，怎么不在E.Coli表达his-tag重组蛋白，然后用Ni-beads纯化啊？答案?
简
单，那个时候根本没有molecular cloning 这些技术，也没有Ni-beads这些东西，Ni-beads
?
是亲合层析的一种，是好多年以后才发明的。这个学生有一天突发奇想，既然inhibitor可?
与
enzyme结合，为什么不能把inhibitor 固定在beads上面，然后用来纯化蛋白呢？后来他试?

一把，结果非常成功。搞笑的是，anfinsen自己很怀疑这个技术是否能work, 勉强答应把自
好?
字署在在那个学生的文章，还强调如果没有别人能重复，自己心就是悬着的。呵呵。从此以
螅?
各种各样的亲合层析层出不穷，成为生物实验室蛋白质纯化的最主要工具。
　“素 完历史，现在介绍一下亲?层析的种类。通用的亲?层析包括IMAC(Immobilized
Metal Affinity Chromatography)和IAC(Immunological Affinity Chromatography)。这些
??
大家应该都熟，类似于Ni-beads, proteinA beads之类的东西，几乎所有人都会用到。需要
??
脑筋的是一些利用特定蛋白质特定性质的亲合层析。比如我们实验室研究的糖基转移酶把，
两个
反应底物，一个是nucleotide-sugar,另一个是一个小蛋白质 EGF-repeats。由于这个酶与?
个底
物都有结合，所以可以把这两种底物分别结合在beads上，然后跑两次亲合层析。AP-1的纯?
呢，
则是利用了转录因子与DNA序列的特异结合。所以呢，在做亲合层析之前，一定要根据蛋白?
本
身的特点来选择相应的ligand。决定了ligand之后呢，就得考虑怎么把ligand偶连在beads?
了。
CNBr活化是最常用的一个方法。原理很简单，CNBr的碳对beads上的羟基发起亲电进攻
产生
一种叫cyclic imido carbonate的中间产物, 蛋白质或者核酸的伯胺基团(primary amine ,
-NH2)
与其发生反应，形成共价键联在beads上。蛋白质的primary amine主要来自于lysine, 如果
偶连
的蛋白没有lysine用这种偶连方法就不好。DNA的primary amine来自于AGC三种碱基。DNA是
?
链互补的结构，碱基上的primary amine都要形成氢键。所以呢，要想把DNA oligo固定好，
匦?
得有不配对的overhang才行。这是一个小窍门，但是给我们的一个启示是，要做好affinity
resin,

了解一些基本的偶连方法的化学原理是很有用的。 　
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发表于 2013-10-26 20:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（十五）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Mon May 30 01:10:07 2005) WWW-POST


　本文献给YL

（十五）AP1的活性测定

　　　第二个模块的实验，DNA affinity chromatography之后我们又跑了一个更精细的
Gel filtration，用的是Amersham卖的Superose 6预装柱子。纯化步骤就只有这么多了。
剩下的就是一些活性测定。无论是sephacryl分出来的组分还是DNA affinity column分出
来的组分，我们都测试了AP-1的活性。方法呢就只有两种，一种是凝胶迁移率变动分析
(EMSA)，另一种是DNA水解酶I 足迹分析 (DNase I footprinting assay)，都可以用来分析
蛋白与特定DNA的结合能力。我过去没做过这两种实验，所以感觉很新奇，做的也格外卖
力，结果也还不错。
　　　Gel Mobility-shift assay 原理很简单，把蛋白质样品和P32标记的寡聚核苷酸探针
一起孵育十几分钟, 然后拿去跑一个低浓度acrylamide胶。如果探针结合上蛋白了，速度
会变慢很多，就会停滞在胶的上段；如果没有结合上，探针就会自由的跑到胶的下段去。
然后把胶拿去做放射自显影就行了。跑胶的装置块头挺大的，是用来跑DNA测序胶的装
置。把两大块玻璃板和两片spacer夹起来之后, instructor先做一个gel plug，就是配少
量gel溶液，然后加过量的TEMED，然后迅速加到玻璃板中间，这些胶还没漏完就会凝
固，所以会封住底端。这是一个小窍门，据instructor 讲，这个方法虽然很粗糙，但是比
其他任何封底的办法都管用。还有一个小窍门。是这样的，由于胶的浓度低，比较脆弱，
另外尺寸比较大。跑完如果把一块玻璃板从胶上拿开的话，胶的某些部分会分别粘在两个
玻璃板上，这样取胶的时候就很容易把整个胶弄破。我们做胶的时候，指导老师要我们把
一块玻璃板的贴着胶的一面硅化（用sigmacote, 成分是氯化有机硅氧烷) 一下，使得这一
面比较疏水，就不会与胶粘在一起了。这样打开胶夹层的时候,胶只会紧紧贴在一面玻璃上
面，把胶和这整块玻璃拿去放射自显影就行了。生物实验要想令人心服口服，没有对照是
不行的。EMSA也不例外。阳性对照很简单，是看看系统能不能work。关键是阴性对照，
来看蛋白质与探针的结合是否特异。EMSA的阴性对照有两种，一种呢，是用来看和探针
的结合的蛋白是不是特异的某一种蛋白。做法很简单，就是蛋白质和探针孵育的同时加入
抗那种蛋白的抗体，抗体识别蛋白质之后会形成更大的protein complex, 在胶看起来就
是探针的迁移率进一步降低了。这叫"supershift"。另一种对照呢，是看蛋白质与探针的结
合是不是与探针序列有关，因为如果是非特异性的结合，纯化就没有意义了。这种对照也
很简单，在蛋白质与探针孵育的同时，加入没有同位素标记的探针来竞争。如果加入完全
同序列的竞争DNA可以削弱protein-DNA interaction，一两个nucleotide不一样就无法
削弱的话，说明看到的探针与蛋白质的结合是跟探针序列紧密相关的。我们在实验中用了
第二种control, 效果挺惊人，仅仅是两个nucleotide和探针不一样，竞争DNA探针就没
法work了。
Gel Mobility-shift assay虽然能够证明一段Oligos是否能和蛋白质结合，却?
是不 能告诉我们该蛋白质到底与哪一小段的序列直接接触。DNAase I footprinting assay 正是 用来解决这个问题的。DNase I 可以随机的分解DNA，正常情况下，一段DNA探针各处被 酶切的可能性大致相当，如果跑胶再做放射自显影的话，看到的会是DNA ladder一样的东西。但是，如果有蛋白与特定区域相结合，DNase I无法酶切那一部分，我们看到的
ladder 就会空缺一部分。这样我们可以知道那一部分没有被切到。这个实验步骤其实不复
杂，但是有些tricky，实验的关键是DNase I 的用量和酶切时间。首先是做同位素标记探针
的stock solution。stock solution里面除了探针以外，还加了非特异DNA,类似于poly(dI-
C) poly(dA-dT)之类的东西。有一种成分引起了我的注意，聚乙烯醇(poly-vinyl alcohol)。
这东东比较粘稠，为什么要加它呢？大家想想看，用来做DNAase I footprinting assay 的
样品都是通过跑柱子的fractions，转录因子必定是被稀释得很厉害的。足迹实验最关键的
就是要保证样品蛋白和探针有充分的结合。聚乙烯醇性质就象一个"分子海绵"，占溶液体积
不说，还跟蛋白质抢夺水分子，所以加入这个东东之后呢，蛋白质和探针的有效浓度都增大
了，这样有利于蛋白质和探针的相互结合。聚乙烯醇的作用原理跟PEG很相似，第三个模
块的实验里面会用到PEG沉淀。探针stock solution配好之后，就是加我们纯化出来的组
分，孵育十几分钟。之后呢就是做DNAse I 酶切。我们这一组里，我和丹麦女生负责做酶
切，这个酶切可是把我们忙坏了。为什么呢？酶切一共有三步，间隔时间很短。第一步是
加Ca2+和Mg2+孵育一分钟, 第二步是加DNase I 孵育一分钟, 第三步是加反应中止液。
我们是三个三个一做, 每20秒加一个样品, 这样三分钟三个样品都完成了。丹麦女孩计时，
然后我加样品。可能是太紧张了把，我们连犯了两次错误，漏加了Ca/Mg，只得重做几个
样品。最后看结果的时候，我还特紧张，因为这是很重要的一份试验数据，最后结果很不
错，还受了老师表扬，呵呵。
　 好了，第二模块的实验，到这里就差不多了。这个培训课两星期的课程也进行了一
半。全体成员放假一天休息，而放假前一天晚上也没有报告。我学校离CSH很近，索性晚
上就溜回去了，顺便还把好友YL硬拉出来听我汇报学习心得，呵呵。
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发表于 2013-10-26 20:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（十六）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Mon May 30 22:27:57 2005) WWW-POST


　　本文献给YL

（十六）浮起来的细胞膜

　　休息了一整天，晚上全体学员和老师去一家sushi店饱餐了一顿生鱼片。第二天
早上，第三个模块的实验开始了。老师是Sue-Hwa Lin，这一个模块是从大鼠肝脏里
面提取胰岛素受体并且做一些鉴定。四个模块的实验之中，我最喜欢这个模块。主要
是因为这是唯一一个设计膜蛋白纯化的实验，而膜蛋白纯化是所有蛋白质纯化中最麻
烦的一类。受体蛋白纯化尤其麻烦，往往可能找不到又快又准确的测活办法。胰岛素
受体即使溶解在去垢剂里面也能与胰岛素接合，所以用简单的binding assay就可以
测活了。相比之下有些受体就不那么好伺侯了，比如我研究的Notch受体，配体也是
膜蛋白，Notch和配体必须都簇集在细胞表面或者固体表面才能有接合，溶液中的游
离状态下根本没法相互作用。
　　Sue-Hwa Lin是一个好老师，喜欢在做实验之前详细给我们讲解背景知识，这一
点上她比其他三位老师都做得好。另外她的助手是一位台湾的中年妇女，在Sue-Hwa
实验室做research assistant professor。这位助手特别nice，给我帮助很大。
　　好了，现在聊一聊纯化的实验步骤。首先是把大鼠肝脏的质膜部分分离出来，然
后呢用去垢剂溶解一下，用凝集素层析来粗分一下组分，然后做受体测活与鉴定。大
家可能注意到，最后纯化出来的受体只是粗产品。事实上，手册上这个实验里面还得
做一步insulin affinity chromatography来精制一下的。但是最近好多年，很多学员
更希望做一些重组蛋白纯化的实验，所以就把原来的实验给切短了。我觉得这种做法
很不明智，因为重组蛋白纯化的实验实在不需要花几千刀来冷泉港学的。
　　细胞膜结构的分离是一门大学问，著名的Methods in Enzymology有专门的一辑
整本都是讲这个的。细胞膜结构主要有核膜，质膜，线粒体，内质网，高尔基体，溶
酶体等等。其中核膜是最容易的，因为细胞核很重，稍微离心一下，就沉淀下来了。
其它的膜结构中呢，线粒体是最重的，质膜由于有胆固醇成分，所以是最轻的。这两
种膜结构也是很好分开的。剩下的膜结构比重比较相似，所以不好分。
　　膜结构分离的方法呢，有很多种，但是变来变去，无非都是两种基本方法的组合：
差速离心+蔗糖梯度离心。差速离心（differential centrifugation）是粗分膜结构的
一种常用方法。其实很简单，就是用不同的速度离心三次。首先用等渗缓冲夜来做组织
的匀浆，然后就开始离心。第一次是低速离心，只用600g，这么小的离心力下，只有
未破的细胞和细胞核才会沉淀下来。细胞主要的膜结构以及细胞质都还在上清里面。
拿上清再做第二次离心，这回离心力大了一个数量级，到了8000g。由于线粒体比其
它膜结构要重一些，所以线粒体沉淀下来，而其它膜结构还在上清里面。去上清进行
第三次离心，这回离心力比前一次又要大一个数量级到了十万g。所有的膜结构都会在
此时沉淀下来，所以也包括质膜。需要强调的是，差速离心的分离是非常粗糙的，并不
是十分干净。下一步的蔗糖梯度离心就要精细得多。但不管是什么分离方法，本质上
都不完美，千万不要指望从某篇文章找到一个方法就能套用。最好的办法是利用细胞
膜结构特征性的一些标记物（比如plasma membrane, 测5' nucleotidase　的活性)

来分析分离方法的好坏，并加以改进。
　　我们分离质膜用的方法稍微特殊一点，省掉了差速离心这一步。这种方法对于分离
大鼠肝脏质膜比较管用，对别的组织就不一定好用了。我们一组四个人，每人都分了一
个新 时? 的大鼠肝脏（解冻后很难闻），然后就是拿刀片剁啊剁。弄碎了之后就加一
种低渗缓冲液，再把碎的肝脏和缓冲液倒到Dounce匀浆器里面做匀浆。匀浆用的缓冲
液里面加有Ca2+，比较重要。钙离子能够促进质膜碎片的聚集，这样在1500g这样小
的离心力下，质膜也能被沉淀下来。我们把匀浆用两层cheese cloth过滤，去掉了很多
结缔组织。然后就是用1500g离心了。拿出离心管一看，果然有一个很松的pellet，包括
了质膜，细胞核之类的东西。然后再把pellet转移到Dounce匀浆器再弄均匀了。下面
就开始准备蔗糖梯度离心(sucrose gradient)。蔗糖梯度离心是十分古老的一种方法，
但直到现在还有很广泛的应用。我们首先往pellet 匀浆里面加69%的 侨芤海?恢钡?
终浓度变为44%为止。蔗糖的浓度十分的重要，如果不准的话，根本就没法分开。我们
有一个折射仪，可以很快的测出溶液的折射率以及对应的蔗糖浓度。这个折射仪看起来
很粗糙，但是却十分好用。下一步呢，就是把加了蔗糖的匀浆转移到超速离心管里，然
后在上层铺一层42.3%的 侨芤海?幼啪褪浅?倮胄牧叫∈ （九万g）。前面提到过，
质膜相比其他膜结构而言是比较轻的，所以呢，在离心的过程中就会浮到上层来。我们
吃罢午饭，就回来看离心管，果然看到一层棕色的东西浮在最上面。这层质膜看起来有
点像果冻，可以用小勺舀出来。到这里质膜的分离就算完成了。　　　　　
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 小中大
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标 题: Re: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（十六）
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Sorry, please be patient. I am still writing more. It is really a laborious
work!

我托朋友和royluo网友联系过，他已经答应我转载到dxy上，由于royluo仍在继续撰写这个系列，我会适时地给大家转载过来，但由于我本身对蛋白纯化不在行，期间可能会由于乱码的原因出现错误还请大家指正出来
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