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标题:【求助】蛋白表达后条带位置与空载一样

TAT[使用道具]
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发表于 2013-10-29 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白表达后条带位置与空载一样


重组质粒测序结果正确无移码，但37°C 诱导表达后，诱导带位置居然与空载相同，降低温度到16°C ，发现在目的带位置有带，但随着诱导时间的延长，目的带越来越淡，而空载诱导带相同的地方的带却越来越浓……

换了同一系列的另一个载体也还是这样，到底为嘛啊？！！！求各位大虾指点啊！！
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2013-10-29 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你说的是上清还是沉淀，不排除有包涵体，一般都采用低温iptg诱导，低温能好点。时间不一定长，有目的蛋白表达就行了。
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2013-10-29 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

会不会上蛋白样的时候流到了旁边那个孔？另一个就是，会不会你的空载体被少量的有基因片段的载体污染了？
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TAT[使用道具]
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发表于 2013-10-29 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 vivian4123 于 2013-10-29 17:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你说的是上清还是沉淀，不排除有包涵体，一般都采用低温iptg诱导，低温能好点。时间不一定长，有目的蛋白表达就行了。

我说的是总菌…… 降低温度好像降解带那儿会淡点，但时间长了（8h）还是会降解……
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TAT[使用道具]
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发表于 2013-10-29 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 huifeng0516 于 2013-10-29 17:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

会不会上蛋白样的时候流到了旁边那个孔？另一个就是，会不会你的空载体被少量的有基因片段的载体污染了？

上样没问题，我跑过很多次了。
污染的可能性也不大，而且空载诱导后表达GST，SDS-PAGE也正好是在27左右的位置。
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2013-10-29 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 TAT 于 2013-10-29 17:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


上样没问题，我跑过很多次了。
污染的可能性也不大，而且空载诱导后表达GST，SDS-PAGE也正好是在27左右的位置。

这就容易解释了，GST-fusion protein经常出现的状况是，目标蛋白被完全／部分降解，结果的到稳定的GST的蛋白，这说明gst也无法帮助这个蛋白稳定表达，降解很快
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发表于 2013-10-29 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

会上传图片了！！~~


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发表于 2013-10-29 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
12345表示不同的重组克隆，载体为pGEX-4T-1，空载诱导后表达27kDa的GST，目的基因约6kDa。
诱导条件为37°C ，IPTG 1.0mM，5h。


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发表于 2013-10-29 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
此为16°C诱导不同时间——时间越长，蛋白降解（？）越明显。

后更换同一系列另一载体，37°C诱导表达后，情况同上图。
求各位大虾们指点~~~~！！！！
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发表于 2013-10-29 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这就容易解释了，GST-fusion protein经常出现的状况是，目标蛋白被完全／部分降解，结果的到稳定的GST的蛋白，这说明gst也无法帮助这个蛋白稳定表达，降解很快

==============================================================================

事实上，我之前遇到一个师兄，他恰好表达过这个蛋白，用的载体也是同一个系列的，他说挺好表达的……

如果是降解，那如何解决呢？老板非要拿到这个蛋白不可啊~~~
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